HIF-1α诱导肺上皮细胞间质转变在百草枯中毒大鼠中的作用

摘要

目的：
　　本实验通过观察百草枯（Paraquat，PQ）中毒后Sprague-Dawley（SD）大鼠肺组织结构、胶原沉积的改变，肺泡灌洗液中III型胶原的改变，大鼠血气检测的变化，肺组织HIF-1α、TGF-β1、β-catenin、Snail、α-SMA等上皮细胞间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）相关蛋白的变化及其之间的相关性，探讨EMT在百草枯致肺纤维化中的作用、HIF-1α与EMT的关系以及寻找HIF-1α激活EMT导致肺纤维化的可能信号通路，进一步明确PQ中毒后肺组织发生纤维化的起始时间，为下一步研究百草枯中毒致肺纤维化的分子机制打下基础。
　　方法：
　　1.动物分组及动物模型的建立
　　将96只健康雄性SD大鼠随机分为对照组（12只）和中毒组（84只）：对照组大鼠予生理盐水1ml一次性灌胃，中毒组按照50mg/kg将20％浓度的百草枯原液用生理盐水稀释至1ml后一次性灌胃，按灌胃后2h、6h、12h、24h、48h、72h及120h分为7个亚组，每组12只。
　　2.观察中毒组大鼠一般情况的改变
　　观察百草枯中毒后大鼠体重、活动、饮食、竖毛、呼吸、反应的改变，记录每组死亡只数以及建模失败只数。
　　3.检测中毒后大鼠动脉血氧分压、二氧化碳分压的变化
　　中毒后大鼠按照对照组、2h、6h、12h、24h、48h、72h及120h采集颈动脉血，检测血气中动脉血氧分压、二氧化碳分压变化。
　　4.检测中毒后大鼠肺泡灌洗液中III型胶原的含量变化
　　中毒后大鼠按照对照组、2h、6h、12h、24h、48h、72h及120h采集肺泡灌洗液，采用ELISA法检测肺泡灌洗液中III型胶原含量的变化。
　　5.中毒后大鼠肺组织病理学的改变
　　中毒后大鼠按照对照组、2h、6h、12h、24h、48h、72h及120h采集肺组织标本行HE及Masson染色，分别评价肺部炎症和纤维化程度，评估百草枯中毒后肺组织病理学改变。
　　6.中毒后大鼠肺组织HIF-1α蛋白的表达变化
　　中毒后大鼠按照对照组、2h、6h、12h、24h、48h、72h及120h采集肺组织标本，采用Western Blot法以及免疫荧光染色法检测HIF-1α蛋白的表达。
　　7.中毒后大鼠肺组织TGF-β1、β-catenin、Snail等EMT相关蛋白表达变化
　　中毒后大鼠按照对照组、2h、6h、12h、24h、48h、72h及120h采集肺组织标本，采用Western Blot法检测α-SMA、TGF-β1、β-catenin、Snail、GSK-3β、E-Cadherin蛋白的表达。
　　结果：
　　1.大鼠百草枯中毒2小时后即可见肺组织急性弥漫性损害，炎性细胞浸润，增厚。中毒后6小时肺泡炎症达到顶峰，到中毒后48小时肺泡炎症基本消退。
　　2.中毒后2小时开始有胶原的沉积，随着时间的延长而进一步加重。5天时见肺泡组织明显破坏，大片纤维结缔组织沉积。
　　3.在中毒早期（2h），肺泡灌洗液中III型胶原含量增多，在以后的每个时间点，III型胶原的含量一直维持在相对稳定的高水平。
　　4.百草枯中毒大鼠中毒后6小时出现血中氧分压下降，之后维持在相对稳定的平台期（6h-72h），中毒后72小时后氧分压进一步下降，同时大鼠二氧化碳分压开始升高，出现高碳酸血症，提示此时大鼠出现严重呼吸困难。
　　5. West Blot检测发现HIF-1α表达水平从中毒后2小时开始持续升高，免疫荧光检测发现在中毒后2小时的大鼠肺组织中开始出现部分HIF-1α荧光染色。对HIF-1α的荧光染色经行半定量评分，我们发现与Western Blot的检测结果一致，HIF-1α表达水平从2小时开始持续升高。
　　6.β-catenin，Snail和α-SMA表达在中毒后2小时开始升高，无功能的磷酸化GSK-3β在中毒后6小时开始升高，对β-catenin和Snail有抑制作用GSK-3β的表达在中毒后24小时后开始下降，作为上皮细胞标记的E-钙粘蛋白（E-Cadherin）表达在中毒后48小时开始降低，而TGF-β1蛋白表达水平在中毒后12小时开始升高。
　　7. HIF-1α表达水平与β-catenin（r=0.761，p=0.018）和Snail（r=0.935，p=0.005）的表达水平呈正相关。HIF-1α表达水平与α-SMA的表达水平无相关（r=0.633，p=0.519）。HIF-1α表达水平与TGF-β1的表达水平无相关（r=0.682，p=0.534）。HIF-1α表达水平与GSK-3β的表达水平无相关（r=0.686，p=0.155）
　　结论：
　　1.百草枯中毒后肺上皮细胞间质转变参与肺纤维化的形成。
　　2.百草枯中毒后HIF-1α的升高并不是由低氧调节的。
　　3.百草枯中毒后HIF-1α可能是通过不依赖GSK-3β的通路调节β-catenin或Snail，从而进一步引起EMT。
　　4.百草枯诱导的肺纤维化在中毒后2小时已经开始。肺纤维化在百草枯中毒后炎症早期即启动。
　　5.百草枯中毒后存在一个病理生理状态相对稳定的阶段（6h-72h），在此时间窗或更早针对HIF-1α及下游通路的潜在靶点进行干预可能减轻EMT的发生，部分逆转肺纤维化的发生。

目录

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英文摘要

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英文缩略语（Abbreviation）

绪论

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

1、百草枯中毒大鼠血氧分压（PaO2）和二氧化碳分压（PaCO2）改变

2、百草枯中毒大鼠肺组织形态学检测结果

3、百草枯中毒大鼠肺泡灌洗液ELISA法检测III型胶原

4、百草枯中毒大鼠肺组织HIF-1α表达的改变

5、百草枯中毒大鼠肺组织EMT相关蛋白表达的改变

6、百草枯中毒大鼠肺组织 HIF-1α表达与 EMT 相关蛋白表达的Pearson相关性分析

讨论

一、EMT是百草枯致肺纤维化的机制之一

二、百草枯中毒HIF-1α的表达早期升高不依赖低氧途径

三、百草枯中毒后HIF-1α的表达与EMT可能的联系

四、百草枯中毒导致肺纤维化的启动时间

五、百草枯中毒后存在一个病理生理状态相对稳定的阶段

结论

本研究的不足

参考文献

文献综述: 循环纤维细胞与肺部疾病

附录1

附录2

附录3

附录4

致谢

攻读学位期间发表文章的情况