通过转基因小鼠模型的建立在体内研究整合素β3胞浆段对血小板功能的调控作用

摘要

本研究通过逆转录病毒感染的造血干细胞移植建立含血小板整合素β3胞浆段突变的转基因小鼠模型，在体内研究整合素β3胞浆段对血小板功能的调控作用。将整合素β3野生型、β3-Δ759（缺失R760GT762氨基酸片段）、β3-Δ754（缺失T755NITYRGT762氨基酸片段）和β3-ΔNITY（缺失 N756ITY759氨基酸片段）的 cDNA分别克隆至带有 GFP编码基因的MSCV MigR1逆转录病毒载体质粒中，用质粒转染BOSC23细胞株包装出带有β3全长及不同突变体的逆转录病毒，再感染β3-/-供体小鼠骨髓细胞，尾静脉注射移植入经致死剂量辐照的野生型C57BL/6小鼠体内，移植后6-8周流式细胞术检测GFP和β3的表达率以评估转基因效率。分离出转基因小鼠的血小板分别检测其游离纤维蛋白原结合能力和在固相化纤维蛋白原上的伸展能力以研究含不同突变的血小板整合素内向外和外向内信号转导功能是否受损。结果我们成功建立了空载(Vector)、β3野生型以及突变型β3-Δ759、β3-Δ754和β3-ΔNITY五种小鼠模型，血小板转基因成功的比率即GFP阳性率为6％-68%。转基因血小板β3表达水平各异，功能实验显示β3野生型转基因血小板β3表达量最低而功能完整，表明β3表达量在一定范围内对转基因血小板功能是否完整不起主要作用。β3-Δ759转基因血小板结合游离纤维蛋白原基本不受影响而在固相化纤维蛋白原上的伸展受影响；β3-Δ754转基因血小板结合游离纤维蛋白原和在固相化纤维蛋白原上的伸展功能均受影响；β3-ΔNITY转基因血小板结合游离纤维蛋白原部分受到影响，固相化纤维蛋白原上的伸展受影响。结论：利用逆转录病毒感染的造血干细胞移植建立血小板转基因小鼠模型是一种相对高通量快速有效的建立转基因小鼠模型的方法。β3-Δ759转基因血小板整合素αIIbβ3外向内信号转导功能受影响而基本保留内向外信号转导功能；β3-Δ754转基因血小板整合素αIIbβ3双向信号转导功能均受损；β3-ΔNITY转基因血小板整合素αIIbβ3部分保留内向外信号转导功能，而外向内信号转导功能受损。在体内水平验证了整合素β3胞浆尾段RGT三个氨基酸序列对血小板内整合素αIIbβ3介导的外向内信号转导起重要作用，而 NITY氨基酸序列与内向外信号转导相关。

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前言

材料与方法

1. 实验材料

1.1质粒、菌种和细胞株

1.2实验动物

1.3培养基

1.4主要试剂

2. 实验方法

2.1 逆转录病毒载体的构建

2.2 含野生型及突变型整合素β3的逆转录病毒的获得

2.3 整合素β3基因敲除小鼠的繁殖

2.4 整合素β3基因敲除小鼠的鉴定

2.5 小鼠造血干细胞移植

2.6 移植鼠血小板表型分析

2.7 转基因血小板的功能分析

实验结果

1．含野生型及突变型整合素β3逆转录病毒载体的构建和鉴定

1.1 重组逆转录病毒载体的酶切鉴定

1.2 重组逆转录病毒载体的测序鉴定

2. 含野生型及突变型整合素β3逆转录病毒最适稀释度和感染效率的测定

2.1质粒钙转

2.2含野生型整合素β3的逆转录病毒最适稀释度测定

2.3 含野生型及突变型整合素β3的逆转录病毒感染效率测定

3. 小鼠基因型的鉴定

4. 对照及转基因小鼠血小板的表型鉴定

4.1 设门选出血小板群的验证

4.2 转基因小鼠血小板GFP阳性率的监测

4.3 对照小鼠β3-/-、β3+/-和β3+/+的β3表达

4.4 转基因小鼠血小板表型的鉴定

5. 对照及转基因小鼠血小板功能实验

5.1 对照及转基因小鼠血小板游离纤维蛋白原结合实验

5.2 对照及转基因小鼠血小板在固相化纤维蛋白原上的伸展

讨论

结论

参考文献

致谢

附录