雌激素通过上调microRNA-17~92a并抑制其靶向蛋白Bim抗成骨细胞凋亡的机制研究

摘要

背景:雌激素对于成骨细胞的抗凋亡作用在雌激素保护成人骨量流失的机理研究中具有极为重要的作用，但其抗成骨细胞凋亡的机理目前尚没有明确的研究结果。近期的研究结果显示microRNA在雌激素介导的一系列细胞反应过程中都具有重要的作用，包括细胞的凋亡及分化。因此我们认为在雌激素抗成骨细胞凋亡的过程中，microRNA也可能参与其中。
　　目的:1.验证雌激素在体内和体外对成骨细胞的抗凋亡作用。2.验证microRNA参与了雌激素的抗成骨细胞凋亡作用。3.通过寻找micro-RNA与细胞凋亡相关的目标蛋白，分析雌激素对目标蛋白的调控作用。
　　方法:1.选用新生C-57小鼠颅盖骨提取成骨细胞进行培养，采用流式细胞仪方法观察成骨细胞在促凋亡因子作用下的凋亡情况以及合并雌激素干扰下的凋亡情况;使用试剂盒对促凋亡因子、雌激素干预的成骨细胞及促凋亡因子、雌激素干预的出生7天小鼠颅盖骨进行caspase-3活力测定;应用western-blot技术测定促凋亡因子及雌激素干预的出生7天小鼠颅盖骨bcl-2/bax比值。
　　2.对不同干预组Dicer表达的测定及抑制Dicer表达后细胞凋亡情况进行分析;利用基因芯片技术测定促凋亡因子及合并雌激素干预的成骨细胞中所有microRNA，筛选有意义的表达变化，并用qRT-PCR技术加以验证;通过体外合成Amo-miRNA，转染后清除micro-RNA的表达，测定各种干预情况下细胞的凋亡情况。
　　3.通过数据库搜索micro-RNA与细胞凋亡相关的靶基因，测定不同干预组中目标蛋白的表达情况;分析雌激素对Dicer、micro-RNA及目标蛋白的调控;建立卵巢切除小鼠模型，分析内源性雌激素对Dicer、micro-RNA及目标蛋白的调控。
　　结果:1.在体外Dex、Etopside和TNF-a干预下，增加了成骨细胞的凋亡并使caspase-3活性出现上调，而雌激素可以明显地降低成骨细胞的凋亡，使caspase-3活性下调;在体内实验中，Dex增强了caspase-3活性，使Bcl-2/Bax值下降，而雌激素使caspase-3活性减弱，使Bcl-2/Bax值上升。
　　2.在体外Dex、Etopside和TNF-a干预下，DicermRNA表达下降，而雌激素可使其表达上升，体内实验中Dex使DicermRNA表达下降，雌激素可以恢复其表达;在体外合成siRNA，转入细胞清除DicermRNA表达，成骨细胞凋亡增加，并可增强促凋亡因子的作用，而雌激素可对抗这种作用;通过基因芯片技术预测micro-RNA-17～92a与雌激素抗成骨细胞凋亡作用有关，并通过qRT-PCR获得了验证;在体外合成Amo-miRNA-17～92a后，转入细胞发现成骨细胞凋亡增加，caspase-3活性上调，这种作用和促凋亡因子相协同，而雌激素可减弱这种作用。
　　3.通过TargetScan预测出micro-RNA-17～92a的目标蛋白为与凋亡相关蛋白Bim;Bim的表达量在促凋亡因子干预下上升，而雌激素可降低它的表达，micro-RNA-17～92a的过表达可抑制Bim的表达，而通过Amo-micro-RNA-17～92a清除micro-RNA的作用后，Bim的表达上升;雌激素可使Dicer、micro-RNA-17～92a表达上调，而使Bim表达下调;在去卵巢动物模型中，获得了和体外实验相同的结果。
　　结论:雌激素在体内和体外都具有抗成骨细胞凋亡的作用，雌激素是通过诱导micro-RNA-17～92a的表达，同时抑制其目标蛋白Bim来实现这种抗凋亡作用的。

目录

声明

摘要

前言

1．雌激素在体外和体内对成骨细胞凋亡的调控作用

1．1 材料

1．1．1 主要试剂

1．1．2 主要仪器设备

1．1．3 实验对象

1．2 实验方法

1．2．1 细胞采集与培养

1．2．2 分组细胞药物干扰

1．2．3 流式细胞仪分析

1．2．4 Western-blot

1．2．5 Caspase-3活性测定

1．2．6 小鼠体内实验

1．2．7 统计学方法

1．3 结果

1．3．1 体外实验根据流式细胞仪测定各组细胞凋亡情况

1．3．2 体外实验根据caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3活性得出

1．3．3 体内实验根据caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3活性得出

1．3．4 体内实验根据western-blot测定结果得出

1．4 讨论

2 Micro-RNA在雌激素抗成骨细胞凋亡过程中的作用

2．1 材料

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 实验对象

2．2 实验方法

2．2．1 细胞采集与培养

2．2．2 实时荧光定量PCR

2．2．3 Caspase-3活性测定

2．2．4 流式细胞仪分析

2．2．5 转染测定荧光活性

2．3 结果

2．3．1 体外实验中RT-PCR测定的各组Dicer mRNA的表达

2．3．2 在体内实验中RT-PCR测定的各组Dicer mRNA的表达

2．3．3 在体外实验中用siRNA转染成骨细胞清除Dicer的表达

2．3．4 在体外实验SiRNA转染成骨细胞清除Dicer表达后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况

2．3．5 在体外实验siRNA转染清除Dicer表达后测定caspase-3活性

2．3．6 根据micro-RNA表达变化筛选结果

2．3．7 转染micro-RNA及抑制物Amo-miRNA-17~92a后各组Hoechst 33258染色结果

2．3．8 转染micro-RNA及抑制物Amo-miRNA-17~92a后各组流式细胞仪测定细胞凋亡百分比结果

2．3．9 转染micro-RNA及抑制物Amo-miRNA-17~92a后各组caspase-3活性测定结果

2．4 讨论

3 Micro-RNA-17~92a靶向蛋白的预测和验证及雌激素对靶向蛋白表达的影响

3．1 材料

3．1．1 主要试剂

3．1．2 主要仪器设备

3．1．3 实验对象

3．2 实验方法

3．2．1 细胞采集与培养

3．2．2 实时荧光定量PCR

3．2．3 Western-blot

3．2．4 动物模型建立

3．2．5 免疫组化

3．2．6 转染测定荧光活性

3．3 结果

3．3．1 Micro-RNA-17~92a靶基因的预测结果

3．3．2 Bim表达变化的体内、外实验结果

3．3．3 雌激素对Dicer、Bim及micro-RNA-17~92a表达调控的验证结果

3．3．4 基于卵巢切除动物模型的各项检测结果

3．3．5 验证miR-17~92a的目标蛋白为Bim的荧光素酶报告结果

3．3．6 体内实验小鼠颅盖骨中micro-RNA-17~92a的qRT-PCR测定结果

3．3．7 通过qRT-PCR对转染有效性测定的结果

3．4 讨论

4 结论

参考文献

综述

攻读学位期间发表与专业相关论文

致谢