绞股蓝多糖的分离纯化、结构分析及生物活性研究

摘要

绞股蓝 Gynostemma pentaphyllum(Thunb.) Makino是一种药食同源的多年生草质藤本植物，具有清热解毒、祛痰止咳等功能，市售以绞股蓝茶为主。目前研究热点主要集中于皂苷类成分的研究。随着多糖研究的逐渐兴起，绞股蓝多糖的药理作用也受到越来越多人的重视。绞股蓝中除皂苷外，多糖是一类重要的具有生物活性的大分子物质，因其水溶性更好，生物利用度更高，具有更好的应用前景。本实验采用低浓度碱对水提后的绞股蓝进行提取，分离纯化得到一种全新的绞股蓝多糖，并对其进行化学结构分析及抗氧化抗炎活性研究。实验结果如下：
　　1.绞股蓝多糖的提取工艺：绞股蓝经甲醇回流脱脂、热水萃取后再采用料液比为1:16的0.5 mol/L氢氧化钠溶液在80℃提取2小时。得到的碱液经盐酸中和后透析，透析液采用双氧水除色素，乙醇沉淀后氮气吹干获得绞股蓝粗多糖。
　　2．绞股蓝粗多糖的分离纯化：绞股蓝粗多糖经DEAE阴离子交换树脂与Sephacryl S-400葡聚糖凝胶树脂分离后，冷冻干燥得到精制多糖 GPP-S。采用HPLC法测定得到 GPP-S纯度为99.9％，分子量为1.2×106 Da。
　　3. GPP-S的结构解析：气相色谱法测定GPP-S单糖组成为鼠李糖：阿拉伯糖：葡萄糖：半乳糖=1:3.72:19.49:7.82，其中葡萄糖含量最高。PMP柱前衍生化法也证明其含有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖四种单糖，并且不含有葡萄糖醛酸。甲基化气质联用结果显示 GPP-S的糖苷键组成为1,4-Glc：1,4,6-Glc：1,6-Gal：1-Ara=17.1:2.78:1.51:1.00。综合NMR结果推断 GPP-S是以1,4-Glc和1,6-Gal为主链，每6个1,4-Glc单元有1个1,4,6-Glc分支，且以1-Ara为末端。GPP-S的化学结构如下图所示。(此处图片省略）
　　4. GPP-S的生物活性测定：绞股蓝具有体外抗氧化及抗炎能力。体外抗氧化实验表明，绞股蓝多糖GPP-S对DPPH?（DPPH自由基）、O2?-（超氧阴离子自由基）和?HO（羟基自由基）均具有一定的清除作用，其中对O2?-清除率最高。大鼠巨噬细胞抗炎模型实验结果表明, GPP-S可以抑制三种炎症因子IL-1β, IL-6和COX-2的基因表达，并对COX-2的基因表达抑制率最强。上述结果提示GPP-S具有延缓因氧化引起的机体衰老和缓解慢性炎症的潜在功效，可以开发为一种药食同源来源的功能食品添加原料。

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第一章 前言

1.1绞股蓝简介

1.2多糖概述

1.2.1多糖的提取

1.2.2多糖的分离纯化

1.2.3多糖的纯度分析

1.2.4多糖的结构分析方法

1.2.5 多糖的生物活性

1.2.6 绞股蓝多糖的研究进展

1.3 本论文的研究目的及意义

第二章 绞股蓝多糖的分离提取及纯化

2.1 实验材料、试剂及仪器

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验试剂

2.1.3 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 绞股蓝粗多糖的制备工艺

2.2.2 DEAE-32离子交换柱层析纯化绞股蓝粗多糖

2.2.3 Sephacryl S-400分子筛柱层析纯化绞股蓝多糖

2.2.4 样品多糖含量测定

2.3.5纯度鉴定和相对分子质量的测定

2.3 实验结果

2.3.1 绞股蓝多糖GPP-S的提取流程图

2.3.2苯酚－硫酸法测定多糖含量的葡萄糖标准曲线

2.3.3 DEAE-32和Sephacry S-400洗脱结果

2.3.4 纯度和相对分子质量测定

2.4 本章小结

第三章 绞股蓝多糖结构分析

3.1 实验材料、试剂及仪器

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验试剂

3.1.3 实验仪器

3.2 实验方法

3.2.1 GPP-S的水解[59]

3.2.2气相色谱法测定GPP-S单糖组成 [60]

3.2.3 PMP柱前衍生高效液相色谱分析单糖组成[61]

3.2.4 紫外全波长扫描分析

3.2.5 红外光谱分析

3.2.6 甲基化反应测定GPP-S糖苷键构型[62]

3.2.7 核磁共振（NMR）分析

3.3 实验结果

3.3.1 气相色谱法测定单糖组成

3.3.2 PMP柱前衍生高效液相色谱分析单糖组成

3.3.3 紫外光谱分析

3.3.4红外结果分析

3.3.5甲基化结果分析

3.3.6 NMR分析

3.4 本章小结

第四章 多糖的生物活性研究

4.1 多糖的抗氧化

4.1.2实验试剂

4.1.3实验仪器

4.1.4 实验方法

4.1.5 实验结果

4.2 多糖的抗炎作用

4.2.1实验材料

4.2.2实验试剂

4.3.3实验仪器

4.4.4实验方法[78, 79]

4.4.5实验结果

4.3 本章小结

第四章 结束语

参考文献

致谢

攻读期间发表的学术论文

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