重力自平衡自由流电泳装置的研制与应用

摘要

自由流电泳（free flow electrophoresis,FFE）指具有电荷差异的待分离混合物随液相背景缓冲液（carrier buffer,CB）通过多通道泵输入由两块绝缘板构成的薄腔后，受到垂直于液体流动方向的不同大小的电场力，实现分离分析的电泳技术。FFE具有操作连续、分离模式多样、无固体支持介质、分离条件温和等特点，既可以用做制备工具，也可以作为分析检测工具。比较大型的FFE装置常用于制备研究，而微流控芯片级FFE（microfluidic FFE,μFFE）常用来对物质进行分析检测。可以说，自从德国科学家Sevsson在1949年首次提出FFE原型以来，有关FFE的研究从未停止。FFE凭着自身强大的优势，已经在小分子（无机或有机化合物）、大分子（多糖、多肽、蛋白质、核酸）、（亚）细胞等对象的分离分析上得到了很多应用。
　　随着科技的发展、技术的进步，FFE技术在多年的发展历程中也不断成熟，各种商业化的FFE仪器也出现在市场上。最早型号的Elphor Vap21 FFE装置于1994年由Bender&Hobein研制成功，并被用作多种生物样本的制备。随后，德国科学家Gerhard Weber对装置进行改进，研发了新一代的FFE，并专门成立了FFE Service GmbH公司在全球范围内提供专门的FFE服务。后来，美国医疗器械巨头BD公司也研制了BDTM FFE型号的FFE仪器并将其投入市场，授权北京博奥生物有限公司为中国地区的独家代理。然而，一台进口FFE仪器售价在120～140万人民币，非常昂贵，限制了FFE技术的推广应用。
　　中国对于FFE的重视程度与国外相比，仍相距甚远。到目前为止，国内并没有具有自主知识产权的商业化FFE问世。国内做FFE研究方向的科学家也为数不多，对FFE的重视程度尚显不足。国内较为引人注意的FFE样机是20世纪80年代末研制的A3-2型 FFE仪器，当时在神州四号飞船上对细胞色素C（cytochrome C，Cyt C）和牛血红蛋白（hemoglobin,Hb）进行过失重电泳分离实验，但并没有商业化。
　　生物分离与分析实验室作为国际上FFE研究方向的佼佼者，自2009年以来一直在尝试国产FFE仪器的商业化，成功研制出基于重力自平衡原理的FFE装置，并在国际上首次提出移动反应界面自由流电泳（free flow moving reaction boundary electrophoresis,FFMRBE）概念，将FFE技术与移动反应界面原理相结合。该FFE装置被成功应用于吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylic acid,PCA）的分离纯化、蛋白质和细胞的分离。
　　然而，该实验室研制的FFE也存在一些问题，比如：（1）装置操作很不方便；（2）容易漏液；（3）外形丑陋，距离商业化仪器的标准甚远。因此，本论文的研究内容就是针对旧FFE装置存在的问题进行改进，力争研制出达到商业化标准的低成本国产FFE装置，同时也对装置的性能进行了全方位的检测，并将新一代的FFE应用到蛋白质、细胞的分离。
　　研制出的新型FFE装置包括4部分：（1）自动化的电路集成系统（包括输液系统、散热系统、温控系统、供电系统）；（2）气液缓冲器（gas cusion injector,GCI）（具备排气泡功能）；（3）分离室（分离腔体积为45mm*120mm*0.6-0.8mm，12个进口、24个出口）；（4）自平衡回收装置（self-balance collector,SBC）。
　　实验表明，装置具备优良的性能，整体设计上基本符合商业化FFE仪器的标准。?曲线实验和气泡产生实验表明装置具有很好的散热效果，在使用10mM pH8.0 Tris-HCl背景缓冲液（carrier buffer，CB）（电导率为720μS·cm-1）、50mM pH8.0 Tris-HCl电极缓冲液（electrode buffer，EB）（电导率为2530μS·cm-1）的条件下，最大可施加电压为400V，不散热条件下的电流较之散热条件下的电流高-5.30％～70.26%。在散热条件下，装置可以使用20mM CB、100mM EB电解质溶液，并将电压施加到300V。同时，装置可以成功分离氨基黑（amino black）、反应红（reactive red）、苏木色精（hematoxylin）3种染料的混合物，牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）、Cyt C、肌红蛋白（myoglobin,Mb）的混合物，基本实现大肠杆菌（Escherichia coli）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）的分离，部分实现嗜热链球菌和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的分离。

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第一章 绪论

1.1电泳技术原理介绍

1.2自由流电泳装置与应用介绍

参考文献

第二章 装置研制和介绍

2.1 引言

2.2 仪器设计

2.3 FFE仪器优化设计的优势

参考文献

第三章 装置性能验证

3.1 FFE装置流型验证

3.2 FFE装置散热性能验证

3.3 高浓度电解质的使用

3.4 小结

参考文献

第四章 FFE的应用—染料、蛋白和细胞的分离

4.1 染料分离

4.2 蛋白混合物分离实验

4.3 细胞分离实验

参考文献

第五章 总结与展望

致谢

攻读学位期间发表的论文和申请的专利

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