NOXIN在肝癌中作用和机制研究及LZP对肝脏脂质代谢影响研究

摘要

第一部分、NOXIN在肝癌中作用和机制研究
　　目的：基因组DNA拷贝数的变化是人类恶性疾病，特别是恶性肿瘤的标志之一。但是，到底何种原癌基因或抑癌基因DNA拷贝数的变化引起了肝细胞肝癌的发生发展尚不确定。本研究中，我们试图通过对人肝癌样本DNA拷贝数分析来发现伴随DNA拷贝数变异的新的潜在的原癌基因或抑癌基因。
　　方法：我们采用单核苷酸多态性全基因组水平DNA拷贝数分析来研究人肝癌样本的DNA拷贝数的变化。采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和免疫组织化学染色(immunohistochemical staining,IHC)的方法评价了肝癌组织样本中NOIXN基因的表达水平。对肝癌细胞株过表达或干扰NOXIN基因的表达后，我们分别通过生长曲线、平板克隆形成、软琼脂克隆形成评价NOXIN基因对肝癌细胞株生长能力的影响，通过划痕实验、trans-well实验评价了NOXIN基因对肝癌细胞株迁移能力的影响，通过流式细胞术分析评价了NOXIN基因对肝癌细胞株细胞周期的影响，通过裸鼠成瘤实验评价了NOXIN基因对肝癌细胞株体内成瘤能力的影响，通过免疫共沉淀(Reciprocal co-immunoprecipitation,Co-IP)实验评价了NOXIN蛋白与DNA聚合酶α之间的相互作用，通过免疫荧光(immunofluorescence,IF)评价了NOXIN蛋白肝癌细胞株中的定位情况。结果：通过对人43对肝癌组织样本全基因组水平DNA拷贝数分析，我们发现了一个最小扩增区，其中包括我们的研究对象NOXIN基因。NOXIN基因表达上调与肝细胞肝癌的肿瘤分级显著相关。过表达NOXIN基因促进了肿瘤细胞的增殖、克隆形成、转移和体内肿瘤形成，而RNA干扰NOXIN基因的表达分别抑制了肿瘤细胞的增殖、克隆形成、转移和体内肿瘤形成。有趣的是，通过Brdu掺入实验，我们发现NOXIN基因过表达通过增强肝细胞肝癌细胞株DNA从头合成从而促进了细胞周期G1向S期的转化。我们进一步发现，NOXIN蛋白与DNA聚合酶α之间相互作用，提示NOXIN基因可能是通过促进了DNA聚合酶引物酶复合体的形成从而促进了DNA的从头合成。
　　结论：基因组水平DNA扩增增加促进了NOXIN基因的过表达，从而通过促进DNA合成与细胞周期进程加快促进了肝细胞肝癌的发生发展。在此过程中，NOXIN蛋白通过与DNA聚合酶α的相互作用发挥作为DNA聚合酶引物酶复合体共分子的功能。
　　第二部分LZP对肝脏脂质代谢影响研究
　　目的：脂肪肝与肝癌严重影响我国人民健康，二者常常伴随发生。部分脂肪肝患者可以发展成脂肪性肝炎，进而导致肝癌发生，但其分子机制不清除。有意义的是本课题组发现和鉴定的LZP(Liver specific ZP domain containing protein)基因在肝癌表达普遍且显著下降，而LZP基因剔出小鼠显示肝脏脂肪沉积，脂质代谢紊乱，提示LZP缺乏导致脂肪肝，进而可能影响肝癌发生、发展。本研究拟基于LZP基因剔出小鼠模型结合人肝癌样本和细胞研究LZP在肝脏脂质代谢过程中的作用、其缺乏对肝癌发生、发展的影响及其分子机制;在此基础上，探讨LZP或者相关致癌分子机制作为靶向防治肝癌策略的可行性。
　　方法：通过对小鼠血液生化指标的检测评价LZP对脂质代谢相关指标的影响，通过组织学检查评价LZP对肝脏形态学的影响，通过免疫组化和免疫荧光评价LZP在肝脏细胞中的定位，通过免疫印迹评价LZP是否分泌及对脂质转运相关蛋白的影响，通过免疫共沉淀评价LZP与脂质转运蛋白的相互作用。
　　结果：血液生化指标的检测发现外周血甘油三酯（TG）含量下降。组织学检查发现肝细胞空泡化增加，油红染色深染增加，血清和肝脏匀浆液中脂质定量分析发现，肝脏中甘油三酯增加，血清中甘油三酯下降。免疫组化和免疫荧光实验发现，LZP蛋白主要定位于细胞交界处，免疫印迹发现LZP可分泌与细胞培养上清中。同时我们发现，LZP蛋白表达增加可以增加脂质转运蛋白ApoB含量，免疫共沉淀发现LZP与脂质转运蛋白ApoB存在相互作用。免疫荧光实验发现LZP表达缺失影响了ApoB蛋白的正确折叠。
　　结论：LZP基因通过与ApoB蛋白的相互作用维持了ApoB蛋白的正确空间构相，从而维持了ApoB蛋白的脂质转运功能。

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目录

第一部分 NOXIN在肝癌中功能和机制研究

前言

一肝癌样本中DNA拷贝数分析

二NOXIN基因在肝癌样本中表达分析

三NOXIN基因过表达促进细胞增殖、克隆形成、细胞迁移和体内肿瘤生成

四 NOXIN基因表达下调抑制细胞增殖、克隆形成、细胞迁移，促进了细胞凋亡

五 NOXIN基因通过促进DNA从头合成使肝癌细胞G1-S期进入增加

六 NOXIN与DNA聚合酶α相互作用并且作为DNA聚合酶引物酶复合体的共因子发挥作用

七总结

第二部分 LZP基因对肝脏脂质代谢影响研究

前言

一 LZP基因表达缺失使肝脏脂质堆积，外周甘油三脂下降

二 LZP基因对脂质合成和利用的影响

三LZP基因对载脂蛋白ApoB影响

四 LZP与apoB之间存在相互作用

五 LZP细胞定位

六总结

参考文献

致谢

攻读学位期间所发表论文