Hedgehog信号通路中Suppressor of Fused与Gli/Ci蛋白复合物的结构与功能研究

摘要

Hedgehog（Hh）信号通路调控多种关键的发育过程，包括胚胎发育和成体组织发生等，其功能异常将会导致多种人类疾病，如出生障碍和肿瘤等的发生。该信号通路主要通过转录因子Gli/Ci发挥作用。Suppressor of fused(Sufu)蛋白是Hh信号通路中调控Gli/Ci的转录靶基因活性的关键蛋白，且在哺乳动物中发挥着更重要的负调控信号通路作用。Sufu和Gli/Ci蛋白均是Hh信号通路中高度保守的成员。Sufu被认为是肿瘤抑制蛋白，其突变与多种癌症（如髓母细胞瘤和基底细胞癌综合症）的发生有关。
　　Sufu蛋白包含两个结构域，自2004年N端结构域被解析结构以来，C端结构域及全长蛋白结构一直未能获得。由于缺乏Sufu蛋白及Sufu-Gli/Ci蛋白复合物的结构数据，Sufu如何利用它的两个结构域与Gli/Ci蛋白相互作用的问题一直存在争议。因此，本论文重点研究Sufu蛋白以及Sufu-Gli蛋白复合物的结构与功能。
　　本文以果蝇和人Sufu蛋白为研究对象，利用原核和昆虫细胞表达体系纯化不同的Sufu蛋白，根据生物信息学预测及蛋白酶限制性酶切进行蛋白片段截短的摸索，结合多种改善晶体衍射质量的优化方法，最终获得高分辨率(2.25(A)-3.2(A))的Sufu蛋白晶体。首次解析出全长人和果蝇Sufu蛋白的晶体结构及两种删除内部无规折叠区域的Sufu突变体蛋白晶体结构。根据两个物种Sufu蛋白的晶体结构及生物信息学方法分析发现Sufu蛋白的两个结构域之间存在介于张开与关闭状态之间的构象变化。
　　在解析了Sufu蛋白的结构以后，我们继续利用分子克隆、生物化学方法鉴定出体外可纯化到的最短用于结合Sufu蛋白的Gli片段，并合成含“SYGHLS”基序的不同长度Gli多肽，与Sufu一起共结晶，最终解析hSufu△60-hGli1(112-128)复合物的晶体结构，其分辨率达到1.7(A)。结合FRET实验结果分析表明，Sufu蛋白的构象变化受到Hh信号的调控，并且与Gli的结合与否相关。
　　根据解析的Sufu-Gli复合物结构，我们对Sufu和Gli的相互识别机制及结合界面的关键氨基酸残基突变影响进行了分析。结合体外pull-down、ITC分析等蛋白相互作用检测方法和细胞内luciferaseassay、cell staining、Co-IP等方法分析，证明了关键氨基酸残基的突变可以破坏Sufu-Gli蛋白复合物之间的相互作用，并抑制Sufu调控Gli的转录活性、Gli细胞内定位及保护Gli不被26S蛋白酶体介导的降解等作用。
　　综上所述，本论文系统地研究了Sufu及Sufu-Gli复合物的结构及功能，从结构的角度阐述了Sufu与Gli/Ci蛋白之间的相互识别和调控的机制。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 信号通路与癌症

1．2 Hedgehog信号通路

1．2．1 Hh信号通路的发现

1．2．2 Hh信号通路中的膜受体蛋自

1．2．3 Hh信号通路传递的主要成员

1．2．4 Hh信号通路对发育和疾病的影响

1．3 Gli／Ci转录因子蛋白家族

1．3．1 Gli／Ci蛋白的结构域

1．3．2 Hh信号调节Gli／Ci活化形式和抑制形式的平衡

1．3．3 哺乳动物系统中Gli蛋白的调控

1．4 Sufu蛋白的研究进展

1．4．1 sufu基因的发现

1．4．2 Sufu与Fu的相互作用

1．4．3 Sufu在调控哺乳动物Hh信号通路中起关键作用

1．4．4 Sufu调控Gli／Ci的方式

1．4．5 Sufu蛋白对肿瘤发生的抑制

1．4．6 Sufu蛋白的结构生物学研究

1．5 课题研究意义

第二章 Sufu蛋白的结构与功能研究

2．1 前言

2．2 实验材料

2．2．1 菌株和细胞系

2．2．2 基因的来源

2．2．3 质粒

2．2．4 主要仪器

2．3 实验方法

2．3．1 生物信息学分析

2．3．2 E．coli BL21(DE3)表达系统

2．3．3 昆虫细胞表达系统

2．3．4 蛋白表达片段的选择

2．3．5 重组质粒的构建

2．3．6 琼脂糖凝胶电泳

2．3．7 SDS-PAGE

2．3．8 常用试剂配制

2．3．9 基因删除突变的引入

2．3．10 E．coli BL21(DE3)中Sufu蛋白的表达

2．3．11 昆虫细胞培养

2．3．12 昆虫细胞中Sufu蛋白的表达

2．3．13 Sufu蛋白的纯化

2．3．14 蛋白的限制性酶切

2．3．15 蛋白质晶体生长

2．3．16 蛋白质甲基化

2．3．17 晶体优化的一般策略

2．3．18 晶体接种

2．3．19 晶体后处理

2．3．20 X-射线衍射数据收集和结构解析

2．3．21 NM分析

2．4 结果与讨论

2．4．1 Sufu蛋白原核表达和纯化

2．4．2 Sufu蛋白昆虫细胞表达和纯化

2．4．3 Sufu蛋白保守性分析和折叠倾向性预测

2．4．4 Sufu蛋白的限制性酶切

2．4．5 Sufu中间删除突变体蛋白的表达与纯化

2．4．6 dSufu蛋白晶体生长与优化

2．4．7 hSufu蛋白晶体生长与优化

2．4．8 hSufu中间删除突变体蛋白晶体的生长与优化

2．4．9 晶体衍射数据收集和结构解析

2．4．10 hSufu的晶体结构

2．4．11 hSufu中间删除突变对Sufu的整体结构没有影响

2．4．12 hsufa的两个结构域之间的相互作用很少

2．4．13 hSufu的两个结构域之间存在构象变化

2．4．14 dSufu的晶体结构

2．4．15 hSufu和dSufu的结构比较

2．4．16 dSufu的两个结构域之间的相互作用

2．4．17 dSufu的两个结构域之问同样存在构象变化

2．5 本章小结

第三章 Sufu-Gli蛋白复合物的纯化与结构解析

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 生物信息学分析

3．2．2 片段构建与纯化

3．2．3 阳离子交换层析

3．2．4 Ni2+柱pull-down分析

3．2．5 Sufu和Gli蛋白的共表达

3．2．6 GST和Amylose柱蛋白纯化

3．2．7 表达载体的改造

3．2．8 多肽合成

3．2．9 Tricine SDS-PAGE

3．2．10 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)

3．2．11 等温滴定微量量热检测(Isothermal titration calorimetry，ITC)

3．2．12 hSufu-Gli蛋白复合物结晶

3．2．13 分子筛检测蛋白与蛋白相互作用

3．2．14 晶体衍射、数据收集和结构解析

3．3 结果与讨论

3．3．1 Gli／Ci蛋白的折叠倾向性分析

3．3．2 Gli／Ci上N端结构域片段纯化摸索

3．3．3 Ci(200-375)与dSufu蛋白复合物的纯化

3．3．4 mGlil上熊够结合hSufu的最短区域

3．3．5 Gli多肽的合成

3．3．6 hSufu△60和hGlil(97-143)的结合能力与FL hSufu一致

3．3．7 Gli多肽氨基酸序列越长其与hSufu的亲和力越强

3．3．8 Sufu／Gli蛋白复合物的晶体生长

3．3．9 hSufuA60-hGlil(112-128)蛋白复合物的结构解析

3．3．10 Sufu／Gli-NTD蛋白复合物的纯化

3．4 本章总结

第四章 Sufu-Gli蛋白复合物的结构与功能研究

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 Consurf分析

4．2．2 突变质粒的构建

4．2．3 多肽的合成

4．2．4 ITC分析

4．2．5 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

4．2．6 Tricine SDS-PAGE

4．2．7 哺乳动物细胞培养和转染

4．2．8 荧光共振能量转移(FRET)分析

4．2．9 抗体

4．2．10 Western Blot分析

4．2．11 免疫共沉淀

4．2．12 荧光素酶报告基因分析

4．2．13 免疫荧光

4．2．14 细胞核组分的提取

4．3 结果与讨论

4．3．1 hSufu△60-hGlil(112-128)蛋白复台物的整体结构

4．3．2 Gli的结合使得Sufu处于关闭状态

4．3．3 Safe的构象变化受到Hh信号的调控

4．3．4 Sufu-NTD和CTD单独不能稳定结合hGlil(97-143)

4．3．5 Sufu和Gli利用保守区域进行相互作用

4．3．6 Sufu-Gli的相互作用界面

4．3．7 Gli／Ci上关键氨基酸残基的突变破坏其与Sufu的结含

4．3．8 Sufu上关键氨基酸残基的突变破坏其与Gli的结合

4．3．9 Sufu和Gli的细胞定位

4．3．10 Sufu对于Gli／Ci的转录活性的调控

4．3．11 Sufu的突变使其失去保护Gli不被降解的作用

4．3．12 Sufu上高度保守区可能介导Sufu与其它蛋白的相互作用

4．3．13 肿瘤中发现的sufu突变对蛋白结构的影响

4．3．14 含“SYGHLS”基序蛋白并非都可以和Sufu发生相互作用

4．4 本章总结

第五章 总结与展望

参考文献

附录

致谢

攻读博士期间发表论文