精子顶体蛋白IQCF1在雄性生殖中功能的研究

摘要

在成熟哺乳动物精子中，存在着一群种类繁多、功能未知的转录本，它们在精子中的保留机制以及潜在的功能也尚不明确。本实验室通过基因表达系列分析技术构建了人成熟精子的SAGE文库，并对精子中的转录本进行了分析。其中有一些无法与SAGE标签数据库匹配的未知标签，在前期实验中，通过改良的两步法分析未知SAGE标签技术，我们在精子中鉴定出一些转录本，其中一个就是IQCF1（IQ motif containing F1）。鉴于已经有大量报道指出，精子中的转录本在精子发生、受精过程和受精卵发育中发挥重要的功能，在本研究中，以小鼠为主要研究对象，通过多种生物化学和分子生物学技术，我们对IQCF1在雄性生殖中的功能进行了深入地研究，并探索了IQCF1在精子中的保留机制。
　　首先，我们克隆出Iqcf1的开放读码框并借助生物信息学技术对蛋白进行了定位和结构域预测；随后在大肠杆菌中表达IQCF1融合蛋白并进行了纯化；免疫家兔制备IQCF1抗血清并亲和纯化抗血清，制备出特异性的IQCF1抗体，用于后续实验。
　　然后，通过Western blotting和反转录PCR，检测IQCF1在小鼠组织器官中的表达情况；利用免疫组化、免疫荧光和免疫电镜等技术在睾丸和精子中定位IQCF1；通过检测睾丸的几种细胞中IQCF1的表达情况，推测IQCF1转录、翻译的过程，以及在转录本精子中保留的机制；将IQCF1与绿色荧光蛋白在真核细胞中融合表达，在细胞中定位IQCF1；检测IQCF1在不同年龄段的小鼠睾丸中的表达来确定IQCF1在睾丸中表达的精确时间，并研究IQCF1表达量与小鼠生精能力的关系；同时在小鼠卵子和受精卵中检测IQCF1的转录本和蛋白，推测IQCF1是否在受精卵发育中发挥功能。
　　最后，通过类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）技术制备Iqcf1基因敲除小鼠，对Iqcf1敲除小鼠在雄性生殖方面的表型，主要包括生殖能力、精子数目和活力、顶体反应率等进行分析，据此研究IQCF1在雄性生殖中的功能；通过酵母双杂交、免疫共沉淀和免疫荧光共定位验证IQCF1在体内体外均与钙调蛋白存在相互作用；根据钙调蛋白在精子获能和顶体反应中的功能，探索IQCF1在雄性生殖过程中的分子机制。
　　对小鼠IQCF1的序列进行生物信息学分析后发现，IQCF1蛋白序列中存在3个IQ结构域，是潜在的钙调蛋白结合区域，蛋白定位预测结果显示IQCF1有60％以上的可能性定位于细胞核中；原核表达的IQCF1重组蛋白纯化效果很好，制备出的IQCF1抗体特异性很强，适用于后续实验。
　　小鼠组织和器官检测结果显示，IQCF1的转录本和蛋白仅仅存在于睾丸和精子中，而在其它器官中并未检测到。睾丸中，Iqcf1在精原细胞和精母细胞中被转录，而在圆形精子细胞中被翻译成蛋白质，且IQCF1存在于精子细胞顶体上；成熟精子中，IQCF1主要存在于顶体上，且在顶体反应后消失。通过将IQCF1与GFP融合表达后发现IQCF1在体外培养的真核细胞定位于细胞核中，与生物信息学预测结果一致，但IQCF1无法稳定表达于体外培养的细胞。
　　新生小鼠睾丸中即有极低的Iqcf1转录本的存在，随着小鼠的性成熟表达量逐渐升高，在出生后35天达到稳定，直至成年；直到出生后19天，小鼠睾丸中才第一次出现IQCF1蛋白，随后表达量逐渐升高，出生后35天达到稳定，直至成年；在老年小鼠和人工隐睾小鼠的睾丸中IQCF1的表达量（0.454±0.0890,0.256±0.021）显著低于正常青年小鼠（1.52±0.144，P<0.001），这些结果都显示小鼠睾丸中IQCF1的表达量与小鼠的生精能力呈正相关。在小鼠的受精卵中，IQCF1的转录本和蛋白质均未检测到，说明IQCF1可能不参与受精卵的早期发育。
　　在Iqcf1基因敲除小鼠中，Iqcf1的第三个外显子丢失了8核苷酸，导致移码和翻译提前终止，仅仅编码80个氨基酸，且3个IQ结构域均被破坏；相比于野生型雄鼠，Iqcf1?/?雄鼠的生殖能力（Iqcf1?/?:9.92±4.97; Iqcf1+/+:13.43±3.31，P<0.01）显著下降，具体表现为Iqcf1?/?雄鼠精子的活力（Iqcf1?/?:53.00±2.65%;Iqcf1+/+:76.67±8.33%，P<0.01）和顶体反应率（Iqcf1?/?:52.53±4.46%;Iqcf1+/+:61.93±6.69%，P<0.01）显著下降；三种检测蛋白相互作用的实验均证实IQCF1与钙调蛋白在精子中存在强烈的相互作用；在Iqcf1?/?雄鼠精子中，钙调蛋白的表达量（Iqcf1?/?:0.834±0.047;Iqcf1+/+:1.201±0.075，P<0.01）以及获能后与钙调蛋白密切相关的精子蛋白酪氨酸磷酸化水平（Iqcf1?/?:2.47±0.275; Iqcf1+/+:6.54±0.885，P<0.01）均显著低于野生型雄鼠。
　　综上所述，IQCF1是一种特异性表达于睾丸精子细胞和成熟精子顶体上的蛋白。在睾丸中，IQCF1转录于精原细胞和精母细胞中，在精子细胞中翻译，残余的转录本保留在成熟精子中；在精子中，通过与钙调蛋白结合，IQCF1与精子获能过程中的酪氨酸磷酸化水平有关，而且与顶体反应密切相关。Iqcf1敲除的雄鼠生殖能力显著下降，具体表现为精子活力以及顶体反应率的下降，说明IQCF1在雄性生殖中发挥重要的作用，其分子机制可能与精子蛋白的酪氨酸磷酸化有关，但仍需进一步的研究。

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缩写和符号

第一章 绪论

1.1 哺乳动物精子发生的生物学过程

1.2 精子获能及顶体反应

1.3 基因敲除技术

第二章 IQCF1的克隆、原核表达和多克隆抗体制备

2.1 背景介绍

2.2 实验仪器和材料

2.3 试剂配制

2.4 实验方法

2.5 实验结果

2.6 讨论

第三章 精子顶体蛋白IQCF1表达的特性

3.1 背景介绍

3.2 实验仪器和材料

3.3 试剂配制

3.4 实验方法

3.5 实验结果

3.6 讨论

第四章 IQCF1在雄性生殖中功能的研究

4.1 背景介绍

4.2 实验仪器和材料

4.3 试剂配制

4.4 实验方法

4.5 实验结果

4.6 讨论

第五章 全文总结

参考文献

致谢

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