恶臭假单胞菌S16中尼古丁降解途径中关键基因的功能及特性研究

摘要

中国已成为世界五大烟草生产国之首，每年消费世界上最多的烟草类制品。约25％的烟叶（梗）、烟末及未能用于烟草加工的废料等因其无法用于烟草生产而丢弃，这些烟草废弃物中含有大量尼古丁，被认为是“有毒的危险废物”，不能直接与生活垃圾一起处理，需经过预处理除去尼古丁等有毒化合物。尼古丁是一种可水溶的神经毒性物质，亚硝化后可产生强制癌物质-尼古丁衍生物亚硝胺丁酮类（如NNK）。因此有效控制卷烟和环境中的尼古丁含量，对环境保护和人类健康有着深远意义。
　　本文以一株能够高效降解尼古丁菌种-恶臭假单胞菌 S16为研究对象，在基因组和蛋白质组数据基础上，对以下6个基因nicA1，hspA，pps_4076（mfs），pps_4079(sapd)，pps_4080(pnao)及pps_4081(nicA2)进行了荧光定量PCR分析，发现pps_4076（mfs），pps_4079(sapd)，pps_4080(pnao)及pps_4081(nicA2)在尼古丁诱导下转录量明显上调。
　　根据RT-qPCR数据，对尼古丁降解过程中2个关键酶尼古丁氧化酶NicA2和假氧化尼古丁氧化酶Pnao进行了定位与功能鉴定。菌株S16中nicA2基因和pnao基因敲除实验，分别验证了这两个基因在尼古丁降解过程中发挥了关键作用。体外表达NicA2蛋白，发现其能催化尼古丁到假氧化尼古丁反应，证明NicA2为尼古丁氧化酶。休止细胞检测突变株S16dpnao催化尼古丁转化并积累假氧化尼古丁，表明Pnao为直接作用于假氧化尼古丁的催化酶，敲除株回补实验验证了Pnao功能。

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第一章 绪论

1.1 尼古丁的理化性质

1.2 环境中尼古丁来源及其危害

1.3 微生物代谢尼古丁的研究进展

1.4 微生物代谢尼古丁中尼古丁氧化酶研究进展

第二章 菌株S16尼古丁代谢差异表达蛋白相关基因转录水平的研究

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

第三章 恶臭假单胞菌S16中尼古丁氧化酶鉴定与功能研究

3.1 引言

3.2 材料与方法

3. 3 结果与分析

3.4 本章小结

第四章 恶臭假单胞菌S16中假氧化尼古丁氧化酶功能鉴定

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

结论与展望

参考文献

附录1实验仪器

附录2实验试剂

附录3 NicA2和Pnao氨基酸序列比对结果

致谢

攻读硕士学位期间论文发表情况

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