特发性房颤相关Connexin45基因突变的识别及功能研究

摘要

背景：心房颤动（房颤）是临床上最常见的心律失常，发病机制尚不明确。缝隙连接蛋白(Connexin，Cx)是缝隙连接的主要组成部分，具有协调心肌机械和电耦联活动的作用，人心肌中的Cx主要包括Cx40、Cx43和Cx45。既往研究发现Cx40基因突变与房颤密切相关，Cx基因是研究房颤的重要候选基因。
　　目的：识别房颤相关Cx45基因突变，揭示其导致房颤的细胞电生理学机制。
　　方法：收集102例无血缘关系的特发性房颤患者和300名健康对照者的临床资料和血标本，抽提基因组DNA。通过PCR反应扩增候选基因Cx45的全部编码区和剪接位点序列，通过PCR-测序和序列比对发现Cx45基因变异。通过测序分析Cx45基因变异在特发性房颤患者和健康对照者中的频率分布以及多物种Cx45蛋白序列比对，分析突变氨基酸在物种进化上的保守性，识别出新的特发性房颤相关Cx基因突变。应用分子克隆技术克隆野生型Cx45基因，通过定位诱变获得突变型Cx45基因。利用基因重组技术构建野生型和突变型Cx45基因的真核表达载体，转染工具细胞，应用膜片钳在细胞水平研究Cx45基因突变对缝隙连接通道电流的影响，应用激光共聚焦显微镜研究其对细胞膜通透性的影响，以揭示Cx45基因突变导致房颤的细胞电生理机制。
　　结果：在l例特发性房颤患者Cx45基因发现了新的错义突变，其所编码的苷酸序列第703位的腺嘌呤变成胸腺嘧啶，导致第235位的甲硫氨酸变为亮氨酸，亦即p.M235L突变。而在300例健康对照者均未发现Cx45基因突变。多物种Cx45基因编码氨基酸序列比对分析显示第235位的甲硫氨酸在进化上完全保守。多个计算机软件预测提示Cx45基因p.M235L突变可能是致病性突变。膜片钳研究发现，Cx45基因突变可导致缝隙连接通道电流消失，而不影响细胞膜通透性，导致触发活动及折返增加，易化房颤的发生。
　　结论：Cx45基因p.M235L突变为导致房颤的新基因突变，该突变导致Cx45形成的缝隙连接跨通道电流消失，引起冲动传导功能障碍，细胞间电冲动脱耦联而引起房颤。

目录

符号说明

第1章 前言

1.1心房颤动概述

1.2房颤的发生机制

1.2.1 经典电生理机制学说

1.2.2 心房重构

1.2.3 自主神经作用

1.2.4分子遗传学机制

1.3缝隙连接与房颤

1.4 研究目的及意义

第2章 特发性房颤相关Cx45基因突变的识别

2.1材料

2.1.1研究对象

2.1.2主要试剂

2.1.3主要试剂盒

2.1.4主要实验设备与仪器

2.1.5细胞株、载体

2.1.6数据库网站，序列及数据分析软件

2.2方法

2.2.1基因组DNA提取

2.2.2引物设计

2.2.3 PCR扩增目的基因

2.2.4 PCR产物的回收纯化

2.2.5候选基因PCR产物的测序

2.3 结果

2.3.1 特发性房颤患者的基础临床特点

2.3.2 提取了全部研究对象的基因组DNA

2.3.3 所设计的引物能对Cx45基因进行特异性扩增、测序

2.3.4 识别出Cx45基因突变

2.3.5 所识别的Cx45基因突变在物种进化上完全保守

2.3.6 所识别的Cx45基因变异的致病性预测

第3章 特发性房颤相关Cx45基因突变的功能研究

3.1材料

3.1.1 主要试剂及细胞

3.1.2 主要试剂盒

3.1.3 主要实验仪器

3.2 方法

3.2.1 克隆Cx45基因

3.2.2 将Cx45基因亚克隆入载体pIRES2-EGFP

3.2.3构建Cx45基因的真核表达载体Cx45-IRES-GFP

3.2.4 细胞株的培养与转染

3.2.5细胞电生理分析

3.2.6 细胞通透性分析

3.3 结果

3.3.1 通过定位诱变获得了Cx45突变体

3.3.2 Cx45纯合突变型缝隙连接通道电生理功能丧失

3.3.3 Cx45杂合突变型缝隙连接通道电生理功能障碍

3.3.4 Cx45突变型缝隙连接通道的选择性通透功能正常

第4章 讨论

第5章 结论

参考文献

致谢

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