non-GCB型弥漫大B细胞淋巴瘤耐药机制及其分子靶向治疗的研究

摘要

第一部分 PRDM1/Blimp1参与non-GCB型弥漫大B细胞淋巴瘤对阿霉素耐药的研究
　　目的：探讨non-GCB型弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）对阿霉素的耐药机制。
　　方法：采用渐增浓度的阿霉素长时间培养OCI-Ly3细胞，以获得耐药性逐渐增强的耐药细胞株；以亲本细胞为对照，采用功能分类PCR芯片分析耐药细胞株中药物代谢相关基因的表达改变；生物信息学分析筛选耐药关键蛋白并构建耐药相关分子作用网络；采用双荧光素酶报告基因系统和ChIP技术检测分析关键基因的表达调控关系和机制；应用慢病毒携带耐药相关调控基因感染细胞，获得稳定过表达相关基因的细胞株；用蛋白免疫印迹和免疫组织化学法检测细胞和组织中耐药关键基因及其调控分子的表达，Spearman检验分析这些分子表达量之间的相关性。
　　结果：筛选性培养成功获得了可在含100ng/mL的阿霉素的培养基中正常生长的non-GCB型弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株，命名为OCI-Ly3/DOX-A100。肿瘤药物耐受与代谢PCR芯片发现MDR1基因是non-GCB型弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株OCI-Ly3/DOX-A100耐药细胞抵抗阿霉素的关键基因之一；双荧光素酶报告基因检测显示PRDM1能抑制MDR1的转录水平；ChIP实验证实PRDM1能结合MDR1基因启动子区域-1132至-996的DNA结构域；在耐药程度不同的耐药细胞株OCI-Ly3/DOX中，随着细胞耐药指数的增加，NF-κB的活性逐渐下降，PRDM1的表达逐渐下调，MDR1的表达呈上调趋势。采用PRDM1慢病毒颗粒感染OCI-Ly3/DOX-A100细胞，结果发现过表达PRDM1后，细胞的MDR1表达水平快速下降，耐药性下降，细胞对阿霉素的敏感性升高；裸鼠移植瘤模型治疗实验证实，与单用阿霉素或MDR1抑制剂zosuquidar相比较，采用zosuquidar联合阿霉素治疗裸鼠移植瘤，能显著抑制移植瘤的生长；免疫组化结果发现，在临床DLBCL组织标本中，MDR1的相对表达水平高于PRDM1的相对表达水平，二者的表达呈负相关关系。
　　结论：成功诱导non-GCB型DLBCL耐药细胞株OCI-Ly3/DOX，耐药指数约为亲本细胞OCI-Ly3的40倍；PRDM1是MDR1的负调控因子，PRDM1可结合MDR1的启动子序列并抑制MDR1的表达；MDR1是参与OCI-Ly3/DOX细胞耐药的重要分子；OCI-Ly3/DOX细胞的耐药性可被MDR1抑制剂Zosuquidar（ZSQ）逆转，OCI-Ly3/DOX细胞中恢复表达PRDM1，可逆转其耐药性；弱化的NF-κB信号可下调PRDM1的表达，解除对MDR1的转录抑制，触发MDR1的转录表达；临床标本中，PRDM1的表达与MDR1的表达呈负相关关系。
　　第二部分冬凌草甲素联合PI3K/mTOR抑制剂NVP-BEZ235靶向治疗non-GCB型弥漫大B细胞淋巴瘤的研究
　　目的：探讨冬凌草甲素联合PI3K/mTOR抑制剂NVP-BEZ235在non-GCB型弥漫大B细胞淋巴瘤体内外的抗肿瘤效应及其分子机制。
　　方法：CCK-8法检测冬凌草甲素及NVP-BEZ235单用或者联合对于细胞增殖的影响并评估两药联用是否有协同作用；流式细胞术检测细胞凋亡和周期；蛋白免疫印迹方法检测凋亡相关蛋白、AKT/mTOR和NF-κB信号通路关键蛋白以及DNA损伤标志物γH2AX的表达；流式细胞术检测细胞用药前后胞内ROS水平；non-GCB型DLBCL小鼠模型验证两药联用在体内的抗肿瘤效应。
　　结果：冬凌草甲素联合NVP-BEZ235可抑制non-GCB型DLBCL细胞OCI-Ly3以及SU-DHL-2的增殖，显著诱导细胞凋亡，两药具有协同效应；冬凌草甲素和NVP-BEZ235都可诱导肿瘤细胞发生G0/G1期阻滞，但两药联合与单用NVP-BEZ235无明显差异；两药联合可抑制肿瘤细胞中AKT/mTOR和NF-κB通路的活性，提高细胞内ROS表达水平，诱导细胞发生DNA损伤；ROS清除剂NAC能够大部分逆转两药联合引起的肿瘤细胞凋亡。冬凌草甲素联合NVP-BEZ235在non-GCB型DLBCL裸鼠移植瘤模型上同样具有明显的协同抗肿瘤效应。
　　结论：本研究使用non-GCB型DLBCL细胞株OCI-Ly3细胞和SU-DHL-2细胞，以及裸鼠皮下成瘤模型从体外和体内实验上探索了冬凌甲草素和NVP-BEZ235联合应用的协同抗肿瘤效应，且证实了其主要机制是通过增强ROS介导的DNA损伤反应诱导细胞凋亡，同时抑制了AKT/mTOR和NF-κB通路的活性。本研究为临床上采用冬凌草甲素联合NVP-BEZ235方案治疗non-GCB型DLBCL提供了理论依据，也为以后开展药物的联合应用以及肿瘤的精准治疗提供了思路。

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第一部分 PRDM1/Blimp1参与non-GCB型弥漫大B细胞淋巴瘤对阿霉素耐药的研究

1 引言

2 材料方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

第二部分 冬凌草甲素联合 PI3K/mTOR 抑制剂 NVP-BEZ235靶向治疗non-GCB型弥漫大B细胞淋巴瘤的研究

1 引言

2 材料方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

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