非小细胞肺癌靶向治疗和耐药机制研究

摘要

表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosinekinase inhibition，EGFR-TKI)和间变淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)抑制剂的临床应用显著改善了非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者的生存。但最终不可避免的发生耐药。因此，本研究将在晚期NSCLC患者中检测ALK融合基因并分析其临床预后意义，为NSCLC靶向治疗的临床实践提供数据参考。另外，建立EGFR-TKI耐药细胞系，分析其生物学性状，开展组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor, HDACi)或联合EGFR-TKI对NSCLC的抗肿瘤作用研究，为NSCLC治疗新策略的开展提供思路。本论文研究内容分为两个部分:
　　第一部分 晚期非小细胞肺癌中ALK融合基因的检测和临床意义分析
　　第一章:晚期非小细胞肺癌中ALK融合基因的检测。采用FISH、IHC和qRT-PCR技术分别检测139例晚期非鳞NSCLC患者的ALK状态，以FISH检测结果为参考，比较IHC和qRT-PCR检测ALK的敏感度和特异度。结果显示，IHC和FISH检测结果的一致性为96.9％，qRT-PCR和FISH检测结果的一致性为95.7％。IHC检测的敏感性和特异度分别为97.7％和96.6％，qRT-PCR检测的敏感性和特异度分别为89.2％和98.7％。结果提示，在临床实践中IHC技术可作为筛选ALK的有效方法，qRT-PCR技术可作为区分ALK具体变异类型的一种补充诊断手段。
　　第二章:晚期非小细胞肺癌中ALK融合基因临床意义分析。采用FISH、IHC和qRT-PCR技术分别检测173例选择性晚期非鳞NSCLC患者的ALK状态。分析患者的临床病理学特征，基因变异类型和临床预后。结果显示FISH、IHC和qRT-PCR检测ALK的阳性率分别为35.5％(59/166)、35.7％(61/171)和27.9％(34/122)。ALK融合基因阳性更倾向发生于不吸烟或轻度吸烟、年轻、伴有印戒细胞特征、分化差的腺癌患者。ALK FISH阳性服用克唑替尼患者的中位无进展生存时间(progression free survival，PFS)为7.6个月，总生存时间长于未接受克唑替尼治疗和基因突变野生型患者，但与EGFR基因突变接受靶向治疗患者的生存时间无显著差异。与IHC1+患者相比，IHC3+/2+患者具有较长的生存时间(P=0.026)。结果提示根据临床病理特征选择性富集NSCLC患者能够提高ALK融合基因阳性检出率，并能高效筛选合适的患者进行ALK抑制剂治疗。ALK蛋白的表达强度对患者治疗方案的选择具有一定的参考意义。
　　第二部分 非小细胞肺癌靶向治疗耐药相关研究
　　第一章:非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药细胞系的建立及其生物学性状分析和耐药后治疗新策略探索研究。采用埃克替尼低浓度持续加量法诱导，建立EGFR-TKI耐药NSCLC细胞系。对其生物学性状进行分析，探索其耐药机制及治疗新策略。结果发现成功构建的耐药细胞系其个别生物学性状不同于亲代细胞，对另外两种EGFR-TKI类药物吉非替尼和厄洛替尼呈高度交叉耐药性，MET基因扩增是引起耐药的重要原因。耐药前后两株细胞系对西达本胺均敏感，耐药后细胞对克唑替尼敏感。克唑替尼或联合埃克替尼能够明显抑制耐药细胞的增殖，减弱耐药细胞中MET及其信号通路中相关调配分子的活化程度，阻滞细胞在G2/M期并诱导细胞凋亡，同时能明显抑制HCC827IR细胞裸鼠移植瘤的生长。研究结果为临床EGFR-TKI类药物的应用及耐药后治疗方案的选择提供了实验参考，也为EGFR-TKI耐药机制研究及耐药逆转药物筛选等提供了必要的实验模型。
　　第二章:组蛋白去乙酰化酶抑制剂或联合表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂对非小细胞肺癌的抗肿瘤作用研究。体内外实验研究西达苯胺或联合埃克替尼对携有不同遗传背景NSCLC的抗肿瘤作用及其相关分子机制。结果发现西达本胺单药对A549、HCC827、HCC827IR具有明显的增殖抑制作用，联合埃克替尼对H1975细胞具有明显的协同抑制作用。西达本胺单药或联合埃克替尼能抑制细胞中RAS/MAPK、PI3K/AKT和/或JAK/STAT信号通路的活化，阻滞细胞周期，激活caspase家族凋亡相关蛋白表达，诱导细胞凋亡。西达苯胺单药或联合埃克替尼能通过降低HCC827、HCC827IR和H1975细胞中β-catenin的表达而发挥抗肿瘤作用。西达苯胺能够上调H1975细胞中E-cadherin的表达而增强其对埃克替尼的敏感性。另外，西达本胺能够明显抑制HCC827IR细胞裸鼠移植瘤的生长，联合埃克替尼能够明显抑制H1975细胞裸鼠移植瘤的生长，且未发生体重减轻及其他毒副反应。本研究结果将为HDACi在NSCLC中的临床应用提供实验数据参考。
　　以上两部分研究明确了不同检测技术检测ALK融合基因的临床适用性，揭示了ALK融合基因在中国NSCLC患者中的临床病理学特征及预后意义;同时，建立了NSCLC EGFR-TKI耐药细胞模型，分析了其生物学性状及耐药分子机制，并对耐药后治疗新策略进行了初步探索研究;另外，通过体内外实验揭示了西达苯胺或联合埃克替尼对携有不同遗传背景NSCLC的抗肿瘤作用及其相关分子机制。本研究结果能为NSCLC靶向治疗的临床实践和治疗新策略的开展提供思路。

目录

表索引

图索引

英文缩略词索引

摘要

第一部分 晚期非小细胞肺癌中ALK融合基因的检测和临床意义分析

研究背景

第一章 晚期非小细胞肺癌中ALK融合基因的检测

摘要

Abstract

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二章 晚期非小细胞肺癌中ALK融合基因的临床意义分析

摘要

Abstract

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 非小细胞肺癌靶向治疗耐药相关研究

研究背景

第一章 非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药细胞系的建立及其生物学性状分析和耐药后治疗新策略探索研究

摘要

Abstract

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二章 组蛋白去乙酰化酶抑制剂或联合表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂对非小细胞肺癌的抗肿瘤作用研究

摘要

Abstract

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

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