小鼠细胞中期染色体ncRNA组成的研究

摘要

中期染色体是真核细胞中最重要且最早发现的亚细胞结构之一，是DNA、蛋白质与RNA通过有序折叠而形成的高度复杂的高阶结构。虽然如此，缘于技术与理论的种种局限，我们对结构的具体组成和装配原则知之寥寥。作为解析其结构与功能的基础，全面鉴定这一复杂结构的基本组成是重要的第一步。
　　近年来，组学技术的高速发展已经使中期染色体的研究再次成为热点和前沿。最近的蛋白组学研究发现了几千种结合在中期染色体上的蛋白质分子，其中有几百种被认为具有RNA结合的可能。相对这一结果，目前已知的和有丝分裂中期染色体相关的RNA仅有U3和rRNA两种。因此，中期染色体上存在大量未被认知的RNA的可能性不容忽视，而这些RNA很有可能在染色体的折叠等方面具有重要作用。
　　为了全面鉴定中期染色体上的RNA组成，本论文优化了一种在高盐处理下可以进一步去除非紧密结合的RNA或核糖核酸蛋白污染的蔗糖梯度离心的样品提取方法，并建立了在有丝分裂染色体形态不发生显著变化条件下的最佳处理条件。应用这一方法，通过靶向5端的标签测序，我们分析了小鼠3T3细胞中期染色体上结合的RNA群体（mCARs）。我们的结果共鉴定出1279种长mCARs，其主要组成为非编码RNA（ncRNA）,其中的长链非编码RNA（lncRNAs）和snoRNA在60种脊椎动物间分别呈现出比已注释的lncRNA以及snoRNA整体更大的保守性。同时也有一些特定的短散在重复序列元件（SINE）RNA在染色体上发生了显著的富集。我们的数据还证实了500种尚未被注释的ncRNA的存在。RNA荧光原位杂交（RNA FISH）等技术的验证结果也与高通量测序结果一致。同时，采用不同的建库方法，本文还通过高通量测序分析了中期染色体上小RNA的组成，发现共有8441种小RNA，其中只有301种是已经注释的miRNA。
　　综上所述，本文中鉴定的中期染色体RNA和以前的蛋白组学及基因组学的研究结果一起，构成了第一个真核生物有丝分裂中期染色体分子组成的综合目录，为进一步揭示有丝分裂中期染色体的结构和分子机制提供了重要基础。

目录

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缩略词表

第一章 绪论

1.1 染色体的结构与组成

1.2 非编码RNA

1.3 非编码RNA的亚细胞分布特点

1.4 中期染色体RNA的研究现状

1.5 本论文的研究内容和意义

1.6 本论文的章节安排

第二章 材料和方法

2.1 引言

2.2 材料

2.3 研究方法

2.4 本章小结

第三章 有丝分裂中期染色体的RNA组成分析

3.1 有丝分裂中期染色体的提取

3.2 有丝分裂中期染色体的长RNA

3.3 有丝分裂中期染色体的小RNA

3.4验证结果

3.5 本章小结

第四章 总结与展望

4.1 研究结果及意义总结

4.2 研究展望

参考文献

附录1 定量PCR引物清单

附录2 3’RACE引物清单

附录3 3’RACE的Sanger测序结果

附录4 RNA FISH反义探针的引物清单

附录5 RNA FISH正义探针的引物清单

致谢

攻读博士学位期间发表的学术论文