肠道益生菌对凡纳滨对虾非特异性免疫功能和抗病力影响的研究

摘要

本论文通过养殖试验和WSSV攻毒实验分析了5株对虾肠道益生菌对凡纳滨对虾非特异性免疫功能和抗病力的影响。研究分为4部分： 第一部分是在基础饲料中分别添加0.1％美人鱼发光杆菌灭活菌、1％美人鱼发光杆菌灭活菌和0.1％美人鱼发光杆菌活菌配制成三种免疫实验饲料，以基础饲料为空白对照组饲料，每处理设3个平行样。对体质量为（4.83±0.36）g的凡纳滨对虾进行为期20天的饲养实验，分别在0、5、10、15和20d进行取样，以血清中的酚氧化酶活性（PO）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）和溶菌酶活性（UL）为免疫指标，探讨了美人鱼发光杆菌作为免疫制剂对凡纳滨对虾非特异性免疫效应的影响；并在投喂免疫饲料后的第22d，按4.2g.kg-1体重的剂量，直接投喂对虾白斑综合征病毒（WhiteSpotSyndromeVirus，WSSV）病料，记录WSSV感染14d内凡纳滨对虾的累积死亡率。结果表明，美人鱼发光杆菌对凡纳滨对虾血清中PO、ACP、AKP、UL、SOD等活性有显著或极显著的影响（P<0.05或P<0.01），明显提高了对虾抵御WSSV感染的能力，其中0.1％美人鱼发光杆菌活菌实验组的抗病毒感染能力最强，WSSV感染14d内累计死亡率为63.3％±5.8％，而对照组为96.7％±7.3％。实验表明，在适宜范围内，美人鱼发光杆菌在一定程度上能提高凡纳滨对虾非特异性免疫水平和增强抵抗疾病的能力，其作为对虾免疫增强剂具有良好的应用前景。 第二部分是在B组基础饲料中分别添加了0.1％和1％大黄鱼弧菌灭活菌制剂和0.1％活菌配制成三种免疫实验饲料；C组基础饲料中分别添加了0.1％和1％鞘氨醇单胞菌灭活菌制剂和0.1％活菌配制成三种免疫实验饲料；以基础饲料为空白对照组饲料，每处理设3个平行样。对凡纳滨对虾体长（11.00±1.18）cm，体质量（12.12±0.36）g，进行为期20天的饲养实验，分别在0、5、10、15和20d进行取样，以血清中的酚氧化酶活性（PO）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）和溶菌酶活性（UL）为免疫指标；并在投喂免疫饲料后的第22d，按4.2g.kg-1体重的剂量，直接投喂对虾白斑综合征病毒（WhiteSpotSyndromeVirus，WSSV）病料，记录WSSV感染14d内凡纳滨对虾的累积死亡率。结果表明，除了个别情况外，大黄鱼弧菌和鞘氨醇单胞菌对凡纳滨对虾血清中PO、ACP、AKP、UL、SOD等活性有显著或极显著的影响（P<0.05），并且在饲料中两种益生菌后后，明显提高了对虾抵御WSSV感染的能力，其中两种益生菌的0.1％活菌实验组的抗病毒感染能力较强，WSSV感染14d内累计死亡率分别为21.67％、45.00％，均显著低于对照组（66.67％）的累积死亡率。 第三部分将两株益生菌PC070573和LV060810分别添加在基础饲料中，以0.1％和1％灭活菌及0.1％活菌添加配制成三种免疫饲料试验组，并以基础饲料为空白对照组，每处理设3个平行样。对体质量为（4.83±0.36）g的凡纳滨对虾进行为期3周天的饲养试验和两周的WSSV攻毒试验，每5d取样1次，检测凡纳滨对虾血清的溶菌酶、酚氧化酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶，探讨两株益生菌对凡纳滨对虾非特异性免疫的影响。结果发现：PC070573的三个免疫组中1％灭活菌组的各项免疫指标较高，LV060810的三个免疫组中0.1％活菌组的各项免疫指标较高；但免疫保护率前者远远高于后者。 第四部分是在凡纳滨对虾的基础饲料中添加了0.1％和1％大黄鱼弧菌灭活菌制剂和0.1％活菌配制成三种免疫饲料试验组，并以基础饲料为空白对照组，每处理设3个平行样。对凡纳滨对虾进行为期20天的饲养实验，分别在0、5、10、15和20d进行取样，以血清中先天免疫相关基因（Toll受体和热休克蛋白）为免疫指标，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和荧光定量PCR的方法，进行基因的mRNA表达检测，并以β-actin为内参照进行基因表达水平的定量分析。结果显示，三个试验组中0.1％活菌制剂组的凡纳滨对虾血清中基因的mRNA表达显著高于对照组（p<0.05），说明益生菌-大黄鱼弧菌可提高凡纳滨对虾免疫相关基因mRNA的表达量，表明在饲料中添加肠道益生菌有利于凡纳滨对虾的生长和抗病、抗逆功能的增强。

目录

文摘

英文文摘

声明

引 言

第一章对虾免疫增强剂的研究现状与进展

1 对虾免疫增强剂的定义和免疫机理

2 对虾免疫增强剂的种类

2.1 免疫活性多糖

2.2 益牛菌

2.3 中草药提取物

2.4 营养因子类物质

2.5 生物活性物质

3 前景与展望

第二章美人鱼发光杆菌对凡纳滨对虾非特异性免疫功能及抗病力的影响

1 材料与方法

1.1 材料与实验处理

1.2 对虾血清的获取

1.3 非特异性免疫因子的测定

1.4 WSSV感染实验

1.5 统计分析

2 结果

2.1 美人鱼发光杆菌对凡纳滨对虾血清中PO活性的影响

2.2 美人鱼发光杆菌对凡纳滨对虾血清中SOD活性的影响

2.3 美人鱼发光杆菌对凡纳滨对虾血清中溶菌酶活性UL的影响

2.4 美人鱼发光杆菌对凡纳滨对虾血清中ACP活性的影响

2.5 美人鱼发光杆菌对凡纳滨对虾血清中AKP活性的影响

2.6 凡纳滨对虾抗WSSV病毒感染实验结果

3 讨论

3.1 美人鱼发光杆菌对凡纳滨对虾非特异性免疫力的影响

3.2 美人鱼发光杆菌对凡纳滨对虾抗病力的影响

4 结论

第三章 大黄鱼弧菌和鞘氨醇单胞菌对凡纳滨对虾非特异性免疫功能及抗病力的影响

1材料与方法

1.1 材料与实验处理

1.2 对虾血清的获取

1.3 非特异性免疫因子的测定

1.4 WSSV感染实验

1.5 统计分析

2 结果

2.1 大黄鱼弧菌、鞘氨醇单胞菌对凡纳滨对虾血清中PO活性的影响

2.2 大黄鱼弧菌、鞘氨醇单胞菌对凡纳滨对虾血清中UL活性的影响

2.3 大黄鱼弧菌、鞘氨醇单胞菌对凡纳滨对虾血清中ACP活性的影响

2.4 大黄鱼弧菌、鞘氨醇单胞菌对凡纳滨对虾血清中AKP活性的影响

2.5 大黄鱼弧菌、鞘氨醇单胞菌对凡纳滨对虾血清中SOD活性的影响

2.6 凡纳滨对虾抗WSSV病毒感染实验结果

3 讨论

3.1 大黄鱼弧菌和鞘氨醇单胞菌对凡纳滨对虾免疫力的影响

3.2 大黄鱼弧菌和鞘氨醇单胞菌对凡纳滨对虾抗病力的影响

第四章益牛菌PC070573和LV060810对凡纳滨对虾非特异性免疫效应的比较

1 材料与方法

1.1 材料与实验处理

1.2 对虾血清的获取

1.3 非特异性免疫因子的测定

1.4 WSSV感染实验

1.5 统计分析

2 结果

2.1 溶藻胶弧菌对凡纳滨对虾血清中PO活性的影响

2.2 溶藻胶弧菌菌对凡纳滨对虾血清中UL活性的影响

2.3 溶藻胶弧菌对凡纳滨对虾血清中ACP活性的影响

2.4 溶藻胶弧菌菌对凡纳滨对虾血清中AKP活性的影响

2.5 溶藻胶弧菌对凡纳滨对虾血清中SOD活性的影响

2.6 凡纳滨对虾抗WSSV病毒感染实验结果

3 讨论

第五章大黄鱼弧菌对凡纳滨对虾toll受体和热休克蛋白基因表达的影响

1 材料与方法

1.1 材料与实验处理

1.2 样品的采集

1.3 RNA样品制备

1.4 去除基因组DNA

1.5 引物设计合成

1.6 RT-PCR反应体系及反应条件

2 结果

2.1 RT-PCR扩增的特异性

2.2 标准曲线的制作

2.3 TOLL受体与热休克蛋白基因的组织特异性表达分析

3 讨论

参考文献

致 谢