黑鲷(Acanthopagrus schlegeli)和半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)微卫星标记的开发

摘要

微卫星标记由于具有多态性高、稳定性好、信息含量大等特点被广泛皮用于生物群体遗传结构分析、系统发生和遗传连锁图谱构建等方面，因此，为了评估鱼类的遗传多样性，进行分子辅助育种以指导生产，迫切需要开发这些鱼类新的微卫星标记。
　　 目前最常用的获得微卫星分子标记的方法就是通过构建文库的方法获得目标鱼类的微卫星位点。本研究运用了两种不同的方法分离了黑鲷和半滑舌鳎两种不同鱼类的微卫星分子标记。一种是通过构建黑鲷基因组文库的方法获得微卫星序列，另一种是利用GENEBANK数据库通过搜索半滑舌鳎已知cDNA文库的EST序列，直接获得具有微卫星序列的方法。
　　 第一种是构建黑鲷的基因组文库，通过用MSEI酶切黑鲷的基因组，连接上酶切特异接头，经过PCR大量扩增后回收纯化250-1000bp之间的小片段，以(GT)13探针与小片段杂交，并用磁珠选择性吸附，富集具有小片段重复序列的微卫星片段，16℃过夜连接到PMD-18载体并转入大肠杆菌，挑取克隆大量培养后用特异引物进行阳性检测，随机选取了148个阳性克隆送样测序。测序结果用软件SSEHUNTER以二碱基重复六次，三碱基重复四次的方式查找微卫星序列，同时去载体序列，接头序列，共获得101个含有微卫星片段的序列，这些序列经过BLAST比对，primer5.0设计引物共得到了83对引物，以30个个体进一步检测共得到了30个具有多态的微卫星位点，这些位点的观测等位基因个数在2到11之间不等，期望杂合度和观测杂合度在0.0667到0.9000,0.0655到0.8637之间，有7个位点偏离了哈德温伯格平衡。
　　 第二种是搜索本实验室已经构建的部分cDNA文库的EST序列，共获得了267对引物，用8个个体进行筛选，24个个体统计，最终分离出82个微卫星标记，检测出多态的比率为30.7％，表明从cDNA文库筛选得到的微卫星标记也具有较高的多态性。相对于基因组文库，cDNA文库获得的微卫星标记更有利于基因的定位，但此前半滑舌鳎cDNA文库分离的标记较少，本研究开发的cDNA文库分子标记将更易于定位在连锁图谱上，为进一步加大半滑舌鳎的连锁图谱密度提供了材料。
　　 半滑舌鳎和黑鲷都是我国主要的养殖鱼类，有广阔的市场前景，过度捕捞，环境污染等问题，营养与疾病控制问题，与重要经济性状相关的基因和遗传决定机制问题等都限制了养殖业的发展，本研究提供的微卫星标记，将为半滑舌鳎和黑鲷的相关鱼类遗传育种的研究提供基础。

目录

文摘

英文文摘

上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单

第一章 引言

1. DNA分子标记概述

1.1 RFLP

1.2 RAPD

1.3 AFLP

1.4 SSR

1.5 SNP

2. SSR分子标记的开发策略

2.1 经典法

2.2 省略筛库法

2.3 富集法

2.4 FIASCO方法

2.5 数据库搜索法

3. SSR分子标记在鱼类遗传育种中应用

3.1 构建连锁图谱及QTL定位

3.2 遗传多样性分析

3.3 血缘鉴定和物种进化

4． 本文研究目的

第二章 黑鲷Acanthopagrus schlegeli分子标记的开发

1 引言

2 实验准备材料

2.1 主要仪器设备

2.2 主要试剂

2.3 材料

3 实验方法

3.1 基因组文库的构建

3.2 微卫星位点的开发

4 结果与讨论

4.1 结果分析

4.2 讨论

第三章 半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis分子标记的开发

1 引言

2 实验材料

3 实验方法

3.1 DAN的提取

3.2 引物的设计

3.3 微卫星标记的筛选

3.4 数据处理

4 结果与讨论

参考文献

硕士期间发表的论文

致谢