中国对虾“黄海1号”SRAP技术体系建立及抗逆性状相关分子标记筛选的研究

摘要

以中国对虾“黄海1号”第12世代人工选育群体为试验材料，结合正交设计法，构建了中国对虾序列相关扩增多态性( Sequence-Related Amplified Polymorphism，SRAP)分子标记技术体系，并以此为技术平台，结合分群分析法(BSA)进行了中国对虾抗高氨氮和高pH性状相关分子标记的筛选和克隆研究。具体研究内容和结果如下：
　　 利用正交设计L16(45)对影响中国对虾SRAP分子标记分析的5个因素(Taq酶，Mg2+，模板DNA，dNTP和引物浓度)在4个水平上进行了优化，筛选出各反应因素的最佳反应水平为：20μL反应体系中包含1.0UTaq酶，2.0mmol/L的Mg2+，40.0ng的模板DNA，0.125mmol/L的dNTP以及0.4μmol/L的引物，引物的退火温度为53.5℃。研究表明各因素的不同水平对扩增结果有显著影响，其中Mg2+影响最大，影响大小顺序依次为Mg2+，Taq酶，引物，dNTP和模板DNA。利用优化的SRAP分子标记体系对中国对虾“黄海1号”第12世代人工选育群体进行了遗传多样性分析的应用，实验结果表明此标记技术可作为中国对虾遗传分析的良好技术工具。遗传多样性分析中共筛选出8对可以扩增出清晰稳定条带的引物组合，共获得171个位点；其中多态性位点154个，占90.08％;有效等位基因数为1.7741，期望杂合度均值为0.4219，shannon多样性指数为0.6055。上述参数值均高于应用AFLP技术对前几代选育群体的遗传多样性分析结果。
　　 采用SRAP分子标记技术，结合BSA法对中国对虾“黄海1号”高氨氮敏感组和耐受组进行分析，筛选出与高氨氮耐受性相关的遗传标记，以期为进一步的基因定位及种质资源保护提供技术支持和理论参考。本研究应用了110对SRAP引物筛选出77对引物进行群体验证分析，共获得1155个标记。根据标记在群体中出现频率和变化规律，筛选出6个可能与高氨氮耐受性相关的分子遗传标记，占标记总数的0.52％，其中敏感性负相关标记1个，耐受性正相关标记5个。对获得的6个分子标记进行回收，连接于pMd-18T载体后转化于大肠杆菌TOP10感受态细胞，进行了克隆和测序。将测序结果进行了BLAST分析比对，发现测得片段序列与数据库中序列同源性较低(＜15％)，未找到与之同源性较高的功能基因。这与利用RAPD和AFLP技术筛选中国对虾生长和抗病标记研究结果类似。推论这些特异性标记可能与高氨氮耐受性性状密切相关，下一步进行大规模的群体相关性研究进行验证。
　　 以经高pH胁迫处理区分出的中国对虾敏感组和耐受组为材料，采用SRAP分子标记技术和BSA法筛选出与高pH耐受性相关的遗传标记。110对SRAP引物经筛选获得在BSA基因池产生差异的引物102对，用于群体验证分析。根据标记在群体中出现频率和变化规律，筛选出7个可能与高pH耐受性相关的分子遗传标记，其中耐受高pH负相关标记2个，正相关标记5个。对获得的7个分子标记进行回收，克隆和测序。将测序结果进行了BLAST分析比对，M2E2-2引物扩增出的片段序列与中国对虾Toll样受体序列同源性为99％，而其他测得片段序列与数据库中序列同源性较低(＜15％)，未找到与之同源性较高的功能基因。根据测序结果，设计了7对引物，进行SCAR标记转化。其中一个标记转化成功，在耐受组出现频率为54.2％，而在敏感组出现频率为零，此标记可作为中国对虾抗高pH性状选择的候选遗传标记。

目录

文摘

英文文摘

引言

第一章 文献综述

第一节 现代生物育种技术及其在水产动物育种中的应用

1 多倍体育种

2 人工诱导雌核发育

3 转基因育种

4 分子标记辅助育种

第二节 分子标记及在对虾育种中的应用

1 常用分子标记概述

2 分子标记在中国对虾研究中的应用

第三节 SRAP技术及其应用

1 SRAP技术的特点

2 SRAP技术的应用

第二章 中国对虾SRAP分子标记体系正交优化及在遗传多样性分析中的应用

引言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 总DNA提取及浓度测定

1.3 PCR反应因素水平及正交试验方案设计

1.4 SRAP-PCR扩增

1.5 引物退火温度的确定

1.6 中国对虾“黄海1号”选育群体遗传结构的SRAP分析

2 结果与分析

2.1 正交试验结果与分析

2.2 PCR因素对反应结果的影响

2.3 因素内各水平对SRAP-PCR结果的影响

2.4 第12代中国对虾“黄海1号”选育群体的SRAP遗传多样性分析

3 讨论

3.1 SRAP反应体系的优化

3.2 中国对虾“黄海1号”第12代选育群体遗传结构分析

第三章 中国对虾“黄海1号”抗高氨氮性状SRAP分子标记筛选及克隆

引言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 胁迫试验

1.3 基因组DNA的提取

1.4 SRAP反应体系与程序

1.5 BSA分池与引物的筛选

1.6 中国对虾群体的SRAP-PCR扩增

1.7 特异片段的回收、克隆与测序

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取

2.2 BSA分池的SRAP-PCR扩增

2.3 敏感组和耐受组的SRAP扩增

2.4 特异条带的回收、克隆及测序

3 讨论

第四章 中国对虾“黄海1号”抗高pH性状SRAP分子标记的筛选与克隆

引言

l 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 BSA分池的PCR扩增结果

2.2 中国对虾群体的SRAP-PCR扩增

2.3 特异片段的回收、克隆与测序

2.4 特异片段的SCAR转化和验证

3 讨论

结论

参考文献

在读期间完成及发表论文情况

致谢