拟穴青蟹几个免疫相关重要基因的克隆与表达分析

摘要

拟穴青蟹是我国重要的海水养殖蟹类，具有较大的经济价值，但在人工养殖过程中容易受细菌、病毒的感染而导致其繁殖和养殖过程中存活率较低，从而给拟穴青蟹的养殖业造成了巨大的损失。如何通过提高拟穴青蟹自身的免疫力来抵抗日益严重的病害己成为目前蟹类养殖业中一个亟待解决的问题。本论文拟从分子生物学的角度，通过研究拟穴青蟹生长过程中及细菌感染下免疫相关的基因表达谱变化规律，探讨这些基因在青蟹免疫过程中的作用，为解决病害问题提供必要的理论基础。
　　 本研究通过构建cDNA文库，借助cDNA末端快速扩增(RACE)和荧光定量PCR技术对与拟穴青蟹免疫相关的基因进行克隆和表达模式分析，利用分子生物学和生物信息学方法进行分析和研究，为解决拟穴青蟹的免疫研究提供基础资料。主要研究结果总结如下：
　　 1.生物体中铁蛋白是一种重要的储存铁的蛋白。运用克隆测序和SMART技术从拟穴青蟹的肝胰腺cDNA文库中分离得到了一条cDNA全长序列，通过Mega软件比对发现，这条cDNA序列与其他物种铁蛋白基因之间具有较高的同源性，经综合分析确定为铁蛋白基因(SpFer)。拟穴青蟹铁蛋白基因由767bp组成，包含一个513bp的开放阅读框，它编码一个分子量约为19440道尔顿，等电点为5.24的蛋白。该基因编码的铁蛋白与凡纳滨对虾的铁蛋白序列有83％相似度。运用Quantitativereal-timePCR技术，研究了铁蛋白基因在拟穴青蟹的肌肉、心脏、眼柄、肝胰腺、精巢、卵巢等各个不同组织及从溞状幼体Z1-Z5、大眼幼体和仔蟹Ⅰ期7个不同发育阶段的时空表达差异，检测的各个组织以及不同的发育时期铁蛋白基因均有表达，其中心脏和肝胰腺中铁蛋白基因的表达量最高，精巢中表达量最低，在不同发育时期溞状幼体Z1期SpFer表达量最高，大眼幼体时期表达量最低。铁蛋白通过调节生物体内铁的含量，抵抗外界损伤，提高机体免疫力，因此，本实验为深入研究拟穴青蟹铁蛋白基因的结构和功能奠定基础。
　　 2.C型凝集素是一类能专一识别糖类化合物，参与生物内在免疫反应的蛋白。运用克隆测序和SMART技术从拟穴青蟹幼体的cDNA文库中分离得到了两条C型凝集素(SpLec1和SpLec2)的cDNA全长序列。SpLec1由756bp组成，编码165个氨基酸，预测蛋白分子量约为18250道尔顿。SpLec2由834bp组成，编码由186个氨基酸组成，分子量约为19700道尔顿的蛋白。运用荧光定量PCR技术研究了C型凝集素基因在拟穴青蟹的肝胰腺、精巢、卵巢、肌肉、眼柄、鳃、血淋巴等各个不同组织，溞状幼体Z1-Z55个不同发育阶段的时空表达差异。分析结果表明SpLec在血淋巴、肝胰腺、精巢、肌肉中均有表达，其中在血淋巴中表达水平最高。在不同的幼体发育时期SpLec均有表达，其中溞状幼体Z4期表达水平最高，Z5期表达水平最低。用副溶血性弧菌对大眼幼体处理，发现开始时SpLec的表达量较低，浸泡3h时表达量上升至最高点，之后回归到原来水平。C型凝集素参与大量的先天免疫防御和细胞连接反应，本研究对了解拟穴青蟹的免疫系统具有重要的参考价值。
　　 3.热激活蛋白HSP90是一种高度保守的蛋白，具有稳定蛋白结构、参与机体免疫、细胞周期调控的作用，在维持机体的稳定中发挥重要作用。采用RACE-PCR技术从拟穴青蟹中克隆到热激活蛋白HSP90基因的cDNA全序列(SpHSP90)。SpHSP90基因cDNA全长2677bp，包含428bp的3’非编码区域(UTR)和83bp5'非编码区，开放阅读框(ORF)为2166bp，预测编码一个分子量为82710道尔顿，等电点为4.62的蛋白。其N端具有HSP90保守的ATPase结构，C端具有HSP90家族保守的序列MEEVD。与三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)相比较，相似性高达98％。运用荧光定量PCR技术研究了HSP90基因在拟穴青蟹肝胰腺、精巢、卵巢、肌肉、眼柄、鳃、血淋巴等各个不同组织中的表达情况，分析结果表明除眼柄外，SpHSP90在上述不同组织中均有表达，其中在心脏和肝胰腺中表达水平较高。分别用副溶血性弧菌和灭活的副溶血性弧菌注射成体拟穴青蟹，结果发现，SpHSP90mRNA表达量在感染副溶血性弧菌后明显提高，6小时后达到最高水平，活菌组的表达量明显高于灭活菌组的表达量(P<0.01)。HSP90可能在拟穴青蟹的免疫和抗菌过程中具有重要作用。
　　 综上所述，本研究克隆得到了3个与拟穴青蟹免疫相关基因的cDNA全长，运用Ouantitativereal-timePCR技术研究了它们在拟穴青蟹不同组织以及不同发育时期的差异表达模式，为拟穴青蟹的免疫研究提供必要的理论基础。