拟穴青蟹与中华绒螯蟹几个胁迫响应相关基因的克隆与表达分析

摘要

拟穴青蟹是我国沿海重要的海洋经济蟹类,具有较大的商品价值,但在人工养殖过程中容易受病原体的侵蚀扰乱、和环境的污染而导致其繁殖和养殖过程中存活率较低,这严重制约了我国养殖拟穴青蟹的发展。中华绒螯蟹也是我国南方广泛养殖的经济蟹类,近年来,中华绒螯蟹的养殖由于密集养殖面临着严峻的死亡问题。除改善环境因素外,了解蟹类自身的免疫防御机制才能更有效的进行蟹类的健康养殖。
　　本论文拟从分子生物学的角度,借助cDNA末端快速扩增(RACE)、荧光定量PCR技术和GeXP多重PCR技术,对与拟穴青蟹和中华绒螯蟹免疫相关的基因进行克隆和表达模式分析,探讨这些基因在青蟹免疫过程中的作用,为拟穴青蟹和中华绒螯蟹的免疫机制提供基础资料。主要研究结果总结如下:
　　1.硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)广泛地存在于生物界中,是一种低分子量(12 KD)、有还原双硫键活力的蛋白质。越来越多的研究表明,它是重要的酶活力调节蛋白,参与许多重要的生命活动。运用克隆测序和SMART技术从拟穴青蟹的肝胰腺cDNA文库中分离得到了一条cDNA全长序列,通过Mega软件比对发现,这条cDNA序列与其他物种硫氧还蛋白基因之间具有较高的同源性,经综合分析确定为硫氧还蛋白基因(SpTrx2)。拟穴青蟹硫氧还蛋白基因由1336 bp组成,包含一个396bp的开放阅读框,它编码一个分子量约为14450道尔顿,等电点为8.08的蛋白。该基因编码的硫氧还蛋白与三疣梭子蟹的硫氧还蛋白序列有87％相似度。运用Quantitative real-time PCR技术,研究了硫氧还蛋白基因在拟穴青蟹的肌肉、心脏、肝胰腺、精巢、鳃、血液等各个不同组织的时空表达差异,检测的各个组织硫氧还蛋白基因均有表达,其中鳃和肝胰腺中硫氧还蛋白基因的表达量最高,血液中表达量最低。用副溶血性弧菌注射成体拟穴青蟹,结果发现，SpTrx2 mRNA表达量在感染副溶血性弧菌后明显提高,6小时后达到最高水平,在12 h后表达量下降一些,24 h后两者的SpTrx表达量回归正常水平。硫氧还蛋白可能在拟穴青蟹的免疫和抗菌过程中具有重要作用。本实验为深入研究拟穴青蟹硫氧还蛋白基因的结构和功能奠定基础。
　　2.用实时定量RT-PCR检测不同盐度(0,2,5,10 and15ppt)对中华绒螯蟹Na+-K+-ATPase，Hsp70(Heat Shock Protein70) and Hsp90(Heat Shock Protein90)基因表达的影响。结果表明在低浓度和高浓度盐度刺激下,Na+-K+-ATPase，Hsp70 and Hsp90三个基因的表达量都会发生显著变化,盐度高低及耐受时间长短对Na+-K+-ATPase，Hsp70 and Hsp90三个基因表达水平产生不同影响,这说明Na+-K+-ATPase，Hsp70 and Hsp90三个基因在中华绒螯蟹的对盐度刺激耐受性上起着很大的作用。
　　3.用GeXP技术检测铜刺激对中华绒螯蟹几个免疫相关基因表达的影响。结果表明在低浓度和高浓度铜刺激下,toll样受体(Toll-like receptor),硫氧还蛋白(thioredoxin)和金属硫蛋白(metallothionein)三个基因的表达量都会发生显著变化,这说明这三个基因可能在中华绒螯蟹重金属吸收和代谢上具有一定功能。HSP70、HSP90和小泛素样修饰物(small ubiquitin-like modifier-1)的分析结果表明,在铜离子刺激的条件下,在96小时之内,Hsp70、Hsp90和small ubiquitin-like modifier-1基因的表达并未出现明显的增加和变动,初步推断中华绒螯蟹热Hsp70、Hsp90和small ubiquitin-like modifier-1基因基因表达的调控与外界铜离子浓度关联不大,不考虑将Hsp70、Hsp90和small ubiquitin-like modifier-1基因基因作为外界铜离子等重金属污染的表征指标。

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第一章 引 言

1.1拟穴青蟹和中华绒螯蟹概况

1.2拟穴青蟹和中华绒螯蟹免疫相关基因的研究现状

1.3荧光定量PCR技术和GeXP多重PCR技术

1.4 SMART RACE cDNA amplification

1.5本论文的研究目的、意义和技术路线

第二章 拟穴青蟹硫氧还蛋白基因Trx2 cDNA的克隆与表达分析

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3讨论

第三章 盐度对中华绒螯蟹Na+-K+-ATPase, Hsp70 and Hsp90 三个基因表达的影响

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3讨论

第四章 铜对中华绒螯蟹免疫相关基因表达的影响

4.1实验材料与方法

4.2 结果

4.3讨论

第五章 小 结

5.1全文小结

5.2本文创新点

5.3展望

参考文献

附录

致谢