西伯利亚鲟CXCR7基因cDNA全长的克隆及表达分析

摘要

西伯利亚鲟(Acipenser baerii)具有重要的经济价值,且因软骨硬鳞鱼类在鱼类进化史上的重要地位,因而具有重要的研究价值。对于西伯利亚鲟侧线系统的研究也逐渐引起学者关注。
　　CXCR7是趋化因子SDF-1的受体,广泛存在于人类(Homo sapiens)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、斑马鱼(Danio rerio)等脊椎动物的不同组织中,在对于斑马鱼侧线原基迁移的研究中发现,CXCR7参与了原基的迁移,其表达于后侧线原基的尾随细胞(trailing cells)中,此外CXCR7还短暂表达于斑马鱼的侧线前神经丘(proneuromast)及神经丘间的细胞(interneuromastic cells)。而对于CXCR7在西伯利亚鲟侧线发育和胚胎发育中的研究情况则未见报告。
　　本研究首次克隆了西伯利亚鲟CXCR7的两种亚型CXCR7a和CXCR7b，CXCR7a的cDNA全长为2325bp(登录号为:JQ034508),包括207bp的5′端非翻译区(UTR)、可编码362个氨基酸的1086bp的开放阅读框(ORF)及包括poly(A)加尾在内的大小为1032bp的3′端非翻译区(UTR);CXCR7b的cDNA全长为2423bp(登录号为:JQ034509),包括209bp的5′端非翻译区(UTR)、可编码370个氨基酸的1110bp的开放阅读框(ORF)及包括poly(A)加尾在内的大小为1104bp的3′端非翻译区(UTR),且对它们编码的蛋白质序列的分子特征进行了分析。氨基酸序列相似性(similarity)分析表明，CXCR7a与人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、斑马鱼(Danio rerio)的CXCR7相似性分别为82.6％、81.4%、80.9%、81.0%;CXCR7b与人、小鼠、非洲爪蟾、斑马鱼的CXCR7相似性分别为82.9%、82.3%、80.8%、82.5%;西伯利亚鲟CXCR7a与其CXCR7b的相似性最高为96.5%。系统进化树分析显示,西伯利亚鲟与斑马鱼聚为一簇,两栖类聚为一簇,其它高等脊椎动物进行聚类。利用TMHMM2.0软件对两种亚型的跨膜区进行预测,发现两者都具有七个跨膜区;利用RasMol软件,对西伯利亚鲟、斑马鱼、人的CXCR7的三级结构进行预测,对比发现它们具有相似的结构。另外,以基因组DNA为模板,利用特异引物进行扩增并测序,从而在基因组DNA水平上证实CXCR7a和CXCR7b来自不同的基因拷贝。
　　利用实时荧光定量技术和geNorm软件,从持家基因β-actin(肌动蛋白)、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、18SrRNA(18S核糖体 RNA)、EF1α(延伸因子1α)、SDHA(琥珀酸脱氢酶复合物,A亚基)中,筛选出稳定度最高的基因为SDHA,并以SDHA作为内参基因,从而对CXCR7a和CXCR7b在胚胎发育的卵裂期、囊胚期、原肠胚中期、宽神经板期、视泡形成期、尾牙形成期、听板形成期、肌肉效应期、出膜期和出膜一天仔鱼的表达进行定量分析,发现两种亚型具有不同的表达模式:两者在宽神经板期、视泡形成期和尾牙分离期均具有较高水平的表达,其中CXCR7a在视泡形成期的表达最高,卵裂期表达最低;而CXCR7b在原肠胚中期表达最高,在囊胚期表达最低,暗示CXCR7a和CXCR7b在胚胎发育过程中扮演不同的角色。
　　用原位杂交技术,对CXCR7在西伯利亚鲟尾达头部期、出膜一天的仔鱼中的表达进行定位分析,发现其在头部的颌部和眼外侧、躯干至尾部的区域有表达,并且其表达随着发育时期的不同而呈现信号分布不同的变化。这些结果为进一步研究CXCR7在西伯利亚鲟侧线系统发育中的作用提供了新的基础资料。

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引言

1 西伯利亚鲟简介

2 侧线系统

3 趋化因子及CXCR7

4生物学研究方法

5 研究目的和意义

第一章 西伯利亚鲟CXCR7基因cDNA全长的克隆及生物信息学分析

1材料和试剂

2实验方法

3 结果

4 讨论

第二章 内参基因的筛选

1材料和试剂

2实验方法

3 结果

4 讨论

第三章 CXCR7基因在胚胎发育过程中的表达分析

1材料和试剂

2实验方法

3 结果

4讨论

第四章 CXCR7基因表达的定位分析

1原位杂交试剂及配制方法

2实验步骤

3 结果

4 讨论

结论

参考文献

附录

致谢