盐酸法降解壳聚糖制备特定聚合度壳寡糖(DP=5-7)的研究

摘要

本论文以壳聚糖为原料,用盐酸在一系列条件下对其进行降解得到系列聚合度的壳寡糖混合物,采用葡聚糖凝胶柱分离,经高效液相色谱法分析,13C和1H核磁共振表征,并结合专一性壳聚糖酶的酶解实验,对其进行鉴定,从而确定了制备特定聚合度壳寡糖(DP=5-7)的方法。结果包括以下几个方面:
　　(1)检测聚合度5以上壳寡糖的薄层层析分离条件的确定。确立了以下薄层层析条件,能够快速准确的检测壳寡糖(DP=1-7)及其分布:HSGF254硅胶板,异丙醇:水:氨水体积比为15:1:7.5展开剂系统,香草醛溶液显色剂,显色条件为175℃烘10分钟。
　　(2)获得特定聚合度(DP=5-7)壳寡糖反应条件的筛选与确定。本实验确立了盐酸降解壳聚糖获得壳寡糖反应的最佳条件为9M盐酸体系,反应温度为60℃。此条件下壳五糖与壳六糖含量最高,可达16.2％,高于以往报道。阐述了盐酸法降解壳聚糖反应中各单因素与反应进程及产物的关系。在反应初始阶段为一级反应,与其他研究者从糖类(如甲壳素、淀粉和纤维素等)的酸水解过程得到的结果相一致。对比不同盐酸浓度和不同温度下实验数据的极差发现:温度对于降解反应的影响稍显著。不同反应时期的反应液中各聚合度壳寡糖组分的分布不尽相同,为保证实验的稳定性和可重复性,所取壳寡糖样品来自于平衡反应液体系。
　　(3)特定聚合度壳寡糖(DP=5-7)的分离与鉴定。采用以葡聚糖凝胶Sephadex G-15(玻璃层析柱内直径1.4cm,高108cm,装填高度为100cm)为介质的层析法分离壳寡糖混合物,获得系列聚合度分布较窄的壳寡糖产物,实现了降解液中壳低聚糖混合物的初步分离。对上样量进行优化,选择0.3g~0.4g上样量得率可达55%以上。本实验采用0.31g上样量,去离子水以3.6ml/h的流速进行洗脱,每0.9ml组分进行收集,壳寡糖得率达到58%。为不同聚合度壳寡糖的研究做了有益的探索。
　　葡聚糖分离组分经NH2P-504E柱(内直径4.6 mm,长250 mm)高效液相色谱法鉴定,分析条件为:乙腈-水(70:30, v/v)以1ml/min的流速在30℃柱温下进行洗脱,洗脱液由Waters2414折光示差检测器在30℃下进行监测。进样体积为20?l。结果显示:与标准品对照,反应液中检测到了预期的主成分——壳寡糖五聚体(保留时间10.7min)和六聚体(保留时间13.3min)。同时HPLC图谱中还出现了另一化合物X(保留时间16.6min)。
　　本研究提出了将壳聚糖酶应用于壳寡糖鉴定的新思路,通过联合使用核磁共振图谱、酶解产物分析的方法,解析13C和1H核磁共振图谱、结合专一性壳聚糖酶的酶解实验,对化合物X进行表征和鉴定,核磁共振条件为:Bruker Avance400 MHz, D2O溶解;酶解条件为:壳聚糖酶粗酶粉(15U/mg,约1mg)与壳寡糖(约1mg)样品在醋酸钠缓冲溶液(50mM,pH6.0)中、37℃下保温反应1h,结果表明:该化合物为壳低聚糖,且聚合度为7,即该化合物为壳七糖。本实验首次成功地表征并鉴定了壳七糖,为更高聚合度壳寡糖的分离和鉴定提供了有力的参考。
　　本实验获得了制备纯度>90%的特定聚合度壳寡糖(DP=5-7)的方法,同时为高聚合度壳寡糖的研究及制备提供了有益的参考。本实验制备的壳寡糖(DP=5-7)为高度脱乙酰化壳寡糖,含量达到97%;若提高得率合并F-6与F-10其纯度亦可达到90%以上;与壳寡糖标准品(DP=5-6)相比,有更好的外观品质。壳聚糖经过盐酸反应其分解率达60%以上,其中壳寡糖(DP5-6)含量达16.2%;壳寡糖样品经过葡聚糖凝胶分离得率达58%,其中得到的壳寡糖(DP=5-7)含量达90%以上。

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引言

第一章 壳寡糖的研究进展

1 几丁质、壳聚糖与壳寡糖的简介

2 壳寡糖的功能及应用（在农业、食品工业、医药领域）

3 壳寡糖的制备方法

4 壳寡糖分离纯化与检测方法

5 问题及展望

6 研究的目的、意义及内容

第二章 聚合度5以上壳寡糖薄层层析条件的确定

1 材料和方法

2 结果与分析

3 本章小结

第三章 特定聚合度（DP=5-7）壳寡糖反应条件的确定

1 材料和方法

2 结果与分析

3 本章小结

第四章 特定聚合度壳寡糖（DP=5-7）的分离与鉴定

1 材料和方法

2 结果与分析

3 本章小结

第五章 结 论

参考文献

致谢