香菇单核菌丝体生长速度的QTL定位及候选基因的验证研究

摘要

香菇(Lentinula edodes)又名，香蕈、花菇、冬菇，在中国已有上千年的栽培历史。中国香菇栽培经历了三次重大的技术改革，即纯培养栽培技术、代料栽培技术和代料栽培花菇技术，不断扩大了中国香菇栽培规模，使中国成为全球最大的香菇生产和出口大国。随着香菇产业的快速发展，香菇遗传育种研究工作的深入开展势在必行。菌丝体是香菇重要的营养器官，它能分解基质并吸取营养供香菇生长发育的需要。香菇单核菌丝体生长速度为数量性状，受控于多基因遗传系统，易受环境的影响。目前，研究数量性状的常用方法主要是对其进行数量性状基因座(Quantitative trait locus，QTL)定位分析，初步探索控制该数量性状的基因，并在此基础上开展分子标记辅助育种等研究工作。
　　本研究基于香菇全基因组序列和香菇高密度SNP遗传连锁图谱，对香菇单核菌丝体生长速度进行了QTL定位，通过生物信息学的方法初步筛选了控制香菇单核菌丝体生长速度的候选基因；然后开发了候选基因 SNP-CAPS标记，结合生物统计学鉴定验证了控制香菇单核菌丝体生长速度的基因；最后，利用实时荧光定量PCR技术，对控制香菇单核菌丝体生长速度的基因进行基因表达量差异分析，并最终确定了控制香菇单核菌丝体生长速度的主要基因。
　　1.香菇单核菌丝体生长速度的QTL定位
　　本研究以香菇菌株135的46个孢子单核体为定位群体，基于本实验室构建的香菇高密度SNP标记遗传连锁图谱，利用复合区间作图法，检测到了3个控制香菇单核菌丝体生长速度的QTL，其中在LG2上检测到了一个显著的QTL，其贡献率接近30％。之后对LG2上的QTL进一步研究发现，该QTL与10个SNP标记相连锁，这些候选SNP标记分布在5个Scaffold中。根据候选SNP标记位点附近的序列信息，通过生物信息学分析，初步筛选到了控制香菇单核菌丝体生长速度的4个候选基因—CP、Tdc、CH、SBDS。
　　2.控制香菇单核菌丝体生长速度候选基因的鉴定
　　本研究利用香菇135菌株的另外42个单核体和香菇其他系列的21个单核体为鉴定验证群体，根据香菇全基因组序列信息和候选SNP标记信息，通过目的片段的特异性扩增和酶切分析，开发了6个候选基因SNP-CAPS标记—TDSS、TDAV、CPSF、CPBS、CPFS和SBTS，得到了这些标记在不同单核菌丝体中的基因型，并结合对应单核菌丝体生长速度的表型值进行T检验，结果发现这6个候选基因SNP-CAPS标记对香菇135系列单核菌丝体生长速度具有显著性差异，同时在香菇其他系列的单核菌丝体检验显示只有SBTS这个同义标记对生长速度的影响不大，表明了控制香菇单核菌丝体生长速度的基因很可能就是Tdc和CP。
　　3.控制香菇单核菌丝体生长速度基因的表达差异分析
　　本研究以长速快的香菇单核菌丝体(65、197、224)和长速慢的香菇单核菌丝体(42、89、143)为供试菌株，通过PDA固体培养基培养和PD液体培养基摇瓶培养两种不同的条件培养收集菌丝，并提取香菇的总RNA，最后对控制香菇单核菌丝体生长速度的基因(Tdc，CH和CP)进行实时荧光定量PCR以检测基因的表达量差异。结果显示 CP基因在长速快的菌株和长速慢的菌株的基因表达量存在明显差异，长速快的菌株的CP基因表达量大于长速慢的菌株；Tdc和CH基因的表达量则没有明显的差异。该结果在基因表达层面上说明了CP基因是控制香菇单核菌丝体生长速度的主要基因，而Tdc和CH基因可能是控制香菇单核菌丝体生长速度的次要基因。
　　控制香菇单核菌丝体生长速度的CP基因的初步鉴定并在基因表达层面上得到了验证，这为香菇单核菌丝体生长模式的分子机制的构建奠定了坚实的基础，并为控制菌丝生长基因及其调控基因的克隆研究提供了一个平台。通过开发候选基因SNP-CAPS标记的方法来鉴定控制香菇单核菌丝体生长速度的候选基因，拓宽了香菇数量遗传研究的思路和技术路线，为食用菌分子辅助育种体系的建立提供依据。

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第一章 引 言

1.1食用菌重要农艺性状的QTL研究概况

1.2 QTL精细定位及候选基因的鉴定和验证策略

1.3分子标记技术及SNP标记在食用菌中的研究现状

1.4食用菌菌丝营养生长的研究现状

1.5 研究目的与意义

第二章 香菇单核菌丝体生长速度的QTL初步定位

2.1 材料与方法

2.2 结果分析

2.3讨论

第三章 控制香菇单核菌丝体生长速度候选基因的鉴定

3.1 实验材料与方法

3.2 结果与分析

3.3讨论

第四章 控制香菇单核菌丝体生长速度候选基因的表达差异

4.1 实验材料

4.2实验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

第五章 总 结

5.1香菇单核菌丝体生长速度的QTL定位

5.2 控制香菇单核菌丝体生长速度候选基因的鉴定

5.3 控制香菇单核菌丝体生长速度基因的表达差异分析

5.4 本研究的创新点和不足之处

参考文献

附录

致谢

论文发表与学术参加情况