大鲵虹彩病毒细胞培养灭活疫苗免疫应答机理与保护效果研究

摘要

大鲵（Chinese giant salamander, Andrias davidianus），俗名“娃娃鱼”，是我国珍稀的名贵特产，具有很高的食用、科研及药用价值，属于国家二级保护动物，已被列入CITES公约附录Ⅰ中。大鲵虹彩病毒病是近年来我国大鲵养殖业中新暴发的一种高度传染性疾病，其病原为大鲵虹彩病毒（Giant salamander iridovirus，GSIV），给大鲵养殖业造成了重大的经济损失，严重阻碍了大鲵养殖业的健康发展。免疫预防被认为是预防水生动物传染性疾病最为有效的方法。本论文对大鲵虹彩病毒细胞培养灭活疫苗的最适免疫剂量、大鲵免疫后的外周血免疫指标变化规律与保护效果以及免疫佐剂的增效作用等进行了研究，旨在建立一种大鲵虹彩病毒病的免疫预防技术。本论文的主要内容如下：
　　1.将健康大鲵80尾随机分成四组，分别以不同剂量（lgTCID50ml-1）的细胞培养灭活疫苗免疫大鲵。在免疫后7、14、21、28d，随机从各免疫组与对照组中选取两尾大鲵，尾静脉采血进行中和抗体滴度测定。免疫30d后，进行攻毒试验，每尾大鲵经腹腔注射100 ul的1.0ⅹ106 TCID50 ml-1的GSIV，连续观察14d，记录死亡情况，评价不同剂量的疫苗免疫保护效果。结果显示，免疫剂量为1.0ⅹ106 TCID50 ml-1的试验组，在人工感染试验后，其相对免疫保护力可达72％。该结果为确定疫苗的最适免疫剂量提供了依据。
　　2.以β-丙内酯灭活的大鲵虹彩病毒（GSIV）通过腹腔注射途径免疫健康大鲵，分别于免疫后的1、2、4、7、14、21、28d采集试验大鲵外周血及组织样，进行血细胞计数和白细胞分类计数，测定细胞的吞噬活性、血清的抗体效价及免疫相关基因的变化，并在免疫后第30天进行攻毒感染试验。结果表明，与对照组相比，红细胞和白细胞数量分别在第4天和第7天呈极显著差异（P＜0.01）。此外，也引起中性粒细胞和单核细胞不同种类白细胞分类百分比的变化。中性粒细胞（neutrophil）分类百分比从第2天开始升高，第4天达到峰值，极显著高于对照组（P＜0.01）；单核细胞（monocyte）和中性粒细胞的变化趋势比较相似，第7天达到峰值，随后淋巴细胞大量增殖，第21天淋巴细胞分类百分比达峰值(70.45±7.52%)。免疫应答早期，吞噬细胞的吞噬活性也迅速提高，吞噬百分比（PP）和吞噬指数（PI）第四天达峰值，分别为38.78±4.33%和3.75±0.52。血清微量中和试验结果表明，免疫后第21天抗体效价最高（341±9.52）。免疫相关基因表达检测结果显示，免疫4d后，免疫组TLR9在肾、脾脏中表达极显著高于对照组（P＜0.01），而MyD88在脾、肾脏中的表达量在免疫7d后极显著高于对照组（P＜0.01）。免疫大鲵的攻毒感染试验结果表明，相对保护率为72%。
　　3.以添加铝胶佐剂和弗氏完全佐剂的GSIV灭活疫苗，为两个试验组，设置无佐剂疫苗对照组和空白对照组（PBS）。分别在免疫后1～6周，每周随机从各免疫组与对照组中选取两尾大鲵，进行尾静脉采血，利用微量中和试验检测各个试验组的抗体水平变化。免疫60天后，进行攻毒感染试验，观察记录死亡状况，计算其相对免疫保护率，比较不同佐剂对GSIV灭活疫苗免疫效果的影响。结果表明，GSIV细胞培养灭活疫苗添加弗氏完全佐剂后，免疫大鲵产生的抗体效价最高（640±15.52），显著高于铝胶佐剂试验组与无佐剂疫苗对照组，且抗体滴度持续时间相对较长，其相对免疫保护率达到90%，显著高于铝胶佐剂试验组（84%）。该结果为使用GSIV灭活疫苗免疫大鲵时选择合适佐剂提供了一定的理论依据。

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第一章 文献综述

1.大鲵简介

1.1 大鲵的分类

1.2 中国大鲵的生物学特性

1.3 中国大鲵的价值

1.4 中国大鲵的资源现状

1.5 中国大鲵的养殖现状

2.大鲵虹彩病毒病研究进展

2.1 临床症状及流行病学研究

2.2 大鲵虹彩病毒的理化及生物学特性研究

2.3 虹彩病毒的诊断与检测技术

3.两栖类免疫系统的研究

3.1 两栖类非特异性免疫

3.2 两栖类特异性免疫

4.影响疫苗免疫效果的因素

4.1 免疫途径

4.2 免疫剂量

4.3 免疫佐剂

第二章 大鲵虹彩病毒（GSIV）细胞培养灭活疫苗最适免疫剂量研究

1.材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 攻毒试验

1.4 数据分析

2.结果

2.1 疫苗的无菌检验与安全性检验

2.2 中和抗体检测

2.3相对免疫保护率

3.讨论

第三章 GSIV灭活疫苗免疫大鲵后相关免疫指标变化与保护效果的研究

1.材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 攻毒试验

1.4数据分析

2.结果

2.1血细胞计数

2.2白细胞分类计数

2.3吞噬细胞吞噬活性

2.4中和抗体效价

2.5免疫相关基因的表达变化

2.6相对免疫保护率

3.讨论

第四章 不同佐剂对GSIV灭活疫苗免疫效果的增效作用

1.材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3攻毒试验

1.4数据分析

2.结果

2.1疫苗的安全性试验

2.2中和抗体效价检测

2.3相对免疫保护率

3.讨论

结论

参考文献

附录一

附录二

致谢