急性病毒性坏死病毒两种功能基因的克隆、表达及功能分析

摘要

急性病毒性坏死病毒（acute viral necrosis virus, AVNV）是20世纪末导致我国北方沿海栉孔扇贝大规模死亡的的重要致病病原。随着AVNV的全基因组序列的测定完成，确定该病毒全基因组序列一共包含123个可能的开放型阅读框(open reading frames, ORF)，其中的44个开放型阅读框具有一定的结构和功能。本论文通过基因克隆、原核表达、真核表达以及体外功能分析等技术研究其中两种功能基因的功能，这对了解AVNV的侵染机制和致病机理，从而为AVNV的防控提供有效理论依据。
　　研究内容和结果如下：
　　第一部分：通过基因克隆技术得到了AVNV ORF86编码的杆状病毒凋亡抑制蛋白基因（IAP-86），将IAP-86基因与pET32a（+）质粒连接构建得到重组质粒pET32a-IAP86，之后将重组质粒转化到 E.coil BL21（DE3）中，使用终浓度0.1％的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行蛋白诱导表达，SDS-PAGE检测显示表达蛋白分子量约为40ku，经Western-blotting和质谱分析证明该蛋白即为IAP-86融合蛋白，Co2+柱纯化后得到了纯化的的IAP-86融合蛋白。
　　第二部分：对原核表达得到的IAP-86蛋白进行功能性分析，首先将重组的IAP-86蛋白用FITC标记，荧光显微镜下观察，发现重组的IAP-86蛋白最终能够与栉孔扇贝血淋巴细胞的细胞核和细胞质结合，提示重组的IAP-86蛋白能够进入到细胞内发挥作用。使用细胞凋亡检测试剂盒针对 IAP-86的抗凋亡作用进行分析，实验结果证实重组的IAP-86蛋白能够在一定程度上抑制栉孔扇贝血淋巴细胞凋亡，凋亡抑制率在7%左右。
　　第三部分：为深入探讨魁蚶中检测到的急性病毒性坏死病毒（acute viral necrosis virus, AVNV）魁蚶株的致病机理以及进一步研究IAP-86蛋白的功能，本实验从感染AVNV的濒死魁蚶外套膜中提取总RNA，反转录获得cDNA。根据NCBI公布的AVNV全基因组序列中ORF86序列设计两对反向套式引物，通过cDNA末端快速扩增（RACE）技术获得ORF865’端和3’端的非编码区，拼接获得全长cDNA序列。Blast序列比对显示，该基因与牡蛎疱疹病毒的相似性为100%，与栉孔扇贝AVNV的相似性为99%，并存在重叠基因。生物信息学分析预测该蛋白不含有信号肽，不存在跨膜区，最大疏水指数为1.800，最小疏水指数为-3.456。存在8个潜在的磷酸化位点（包括5个丝氨酸、1个苏氨酸和2个酪氨酸），存在1个潜在的O-糖基化位点，不存在潜在的N-糖基化位点；其抗原表位主要集中在8-11、14-16、28-39、75-76、88-95、97-100和147-158位氨基酸。
　　第四部分：在使用原核表达技术对AVNV解旋酶进行表达未获得成功的前提下，尝试使用酵母表达系统对AVNV解旋酶进行真核表达，本部分通过基因克隆技术获得了表达 AVNV解旋酶的开放阅读框-ORF66，并将该基因连接到 pPIC9K表达载体上，构建获得了真核表达载体pPIC9K-ORF66。

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引言

AVNV的全基因组序列测定

AVNV蛋白质组学的研究

AVNV诊断技术

AVNV功能基因的研究进展

杆状病毒凋亡抑制蛋白的研究现状

AVNV魁蚶株在魁蚶中的发现

解旋酶的研究现状

第一章 AVNV IAP-86基因的克隆和原核表达

第一节AVNV杆状凋亡抑制蛋白IAP-86基因的克隆

1 材料和方法

2 实验结果

第二节 AVNV IAP-86原核表达菌株的构建

1 材料和方法

2 实验结果

第三节 重组蛋白的诱导表达和纯化

1 材料和方法

2 实验结果

本章讨论

第二章 AVNV IAP-86蛋白的细胞定位及抗凋亡研究

第一节 AVNV IAP-86蛋白的细胞内定位

1 材料和方法

2 实验结果

第二节AVNV IAP-86蛋白的抗凋亡性分析

1材料和方法

2 实验结果

本章讨论

第三章 AVNV魁蚶株IAP-86基因全长cDNA序列克隆及生物信息学分析

第一节 环化RACE克隆AVNV魁蚶株 IAP-86基因全长cDNA

1材料和方法

2 实验结果

第二节 AVNV魁蚶株 IAP-86基因的生物信息学分析

1 实验方法

2 实验结果

本章讨论

第四章 AVNV解旋酶基因的克隆和真核表达载体的构建

第一节 AVNV解旋酶基因的克隆

1材料和方法

2 实验结果

第二节 AVNV 解旋酶基因真核表达菌株的构建

1 材料和方法

2 实验结果

本章讨论

参考文献

致谢

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