草鱼抗病毒转基因P0代的构建和鱼类Chordin基因的克隆及其对金鱼尾型的影响

摘要

目前，鱼类育种领域的一个重要方向是基因功能和转基因研究。通过发掘重要性状主效基因或其基因型，开展基因与性状关联分析或转基因研究，从而选育出性状优良的新品种，有利于鱼类的养殖产业不断进步与发展。
　　为探索草鱼抗出血病新技术，本研究采用衣壳蛋白靶向灭活（Capsid-targeted viral inactivation,CTVI）策略，利用Tgf2转座子元件，构建了带爪蟾EF1α和鲤热休克蛋白70的2种不同启动子的CTVI转基因质粒 pTgf2-EF1α-VP3-SN和pTgf2-Hsp70-VP3-SN。该2种质粒均含有草鱼GCRV病毒衣壳蛋白VP3与金黄色葡萄球菌核酸酶(Staphylococcus nuclease,SN)融合表达阅读框。通过将2种CTVI转基因质粒与体外合成的Tgf2转座酶5'加帽 mRNA共同显微注射入草鱼1-2细胞期受精卵，获得了带2种不同启动子的CTVI转基因草鱼群体。PCR和测序结果显示，2种转基因阳性草鱼基因组中均含有外源GCRV病毒衣壳蛋白VP3与金黄色葡萄球菌核酸酶SN基因片段，阳性率分别为40.2％和37.0%，表明Tgf2转座子已成功介导CTVI融合表达基因整合到草鱼基因组中。本研究共获得了120尾P0代CTVI转基因个体草鱼，为将来构建抗出血病草鱼新品系奠定了材料基础。
　　本文还获得了团头鲂Chordin基因cDNA的全长序列。团头鲂Chordin基因全长为3736bp，开放阅读框为2829bp，可编码942个氨基酸，其中包含18个氨基酸信号肽和924个氨基酸成熟肽。与人类和斑马鱼一样，团头鲂Chordin成熟多肽也包含2个结构域：CHRD和vWC结构域。团头鲂Chordin与人Chordin、金鱼Chordin A/B和斑马鱼Chordin的序列相似度分别为68%、89%、88%和68%，由此可见团头鲂Chordin在进化上具有很强的保守性。RT-PCR分析结果表明，团头鲂Chordin基因在不同胚胎时期具有不同的表达模式，Chordin基因在0hpf至32hpf表达量较为恒定，但是从36hpf阶段，表达量呈逐渐降低的趋势；在成鱼团头鲂中，Chordin在除外其他组织中都有表达，在脑中的表达量最高。整胚原位杂交结果显示，在团头鲂Chordin mRNA主要在胚胎的尾部表达，其中16pdf胚胎表达量较高。饥饿处理实验结果表明，团头鲂Chordin mRNA在脑中的表达量呈急剧升高后降低然后又升高渐渐趋于稳定的趋势；注射生长激素处理实验表明，团头鲂Chordin mRNA在脑中表达量随着hGH注射剂量的升高而呈逐渐降低的趋势，通过对团头鲂Chordin基因的克隆和功能研究进一步为团头鲂良种的选育奠定了基础。
　　此外，本论文进一步研究了Chordin基因与鱼类尾型（单尾型-双尾型）性状的相关性。对于鱼类尾鳍性状决定因子的研究很少有报道，金鱼作为我国重要的观赏性经济鱼类，其表型性状尾鳍一直是人工选择和培育的重要方向。金鱼生长周期短，但是尾鳍性状的变异率较大，难以达到大规模培育和养殖单一品种的要求。目前，已有研究表明Chordin A基因的突变对金鱼尾鳍骨骼系统形成、单尾或双尾表型起着重要的作用。本研究采用分子生物学方法对不同品种金鱼及其杂交鱼进行了研究，发现Chordin A基因中含有一段18bp的特异碱基核苷酸序列第6为A突变为G，16位G突变为T时，性状表现为双尾鳍，且表型为双尾鳍的Chordin A基因型一定是双尾纯合位点。在多种鱼中对这段特异碱基核苷酸序列对比分析可知，该序列具有较高的保守性。原位杂交对单、双尾鳍的比较结果表明，Chordin A mRNA在单尾鳍胚胎中表达量高于双尾鳍，MyoD mRNA在单尾鳍胚胎中信号由背至尾逐渐减弱，而MyoG mRNA在双尾鳍中信号由背至尾逐渐增强，Ntl mRNA在双尾鳍胚胎中的尾部表达，Bmp4 mRNA在单、双尾鳍胚胎中表达量都很高。通过CRISPR-Cas9系统对Chordin A基因的敲除实验结果表明，Chordin A基因中的一个等位基因的突变，受另一等位基因的控制，实验进一步验证了金鱼单、双尾鳍的形成与卵质内Chordin A mRNA浓度有着密切的关系，其能够调控双尾鳍性状的形成。研究表明Chordin A基因的突变是双尾鳍形成的必要条件，但可能不是充分条件。

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引言

一、草鱼抗出血病研究进展

二、Chordin基因的结构、作用机制及研究进展

三、水产动物尾鳍性状决定因子的研究进展

第一章 草鱼呼肠孤病毒衣壳蛋白靶向灭活转基因P0代的构建

1.1材料和方法

1.2实验结果与分析

1.3 讨论

第二章 团头鲂Chordin 基因cDNA全序列的克隆及功能研究

2.1实验材料、仪器和试剂

2.2实验方法

2.3实验结果与分析

2.4讨论

第三章 Chordin A 基因对金鱼及其杂交鱼尾型的影响研究

3.1实验材料与仪器

3.2实验方法

3.3实验结果与分析

3.4讨论

结论与展望

（一）结论

（二）展望

参考文献

附录：英文缩略语表

致谢

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