锦鲤疱疹病毒单交叉引物等温扩增可视化检测方法的建立

摘要

锦鲤疱疹病毒病（Koi herpes virus disease，KHVD）是危害养殖鲤最为严重的病毒性疾病，世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须申报的疾病，我国将其列为二类动物疫病。KHV具有高度传染性，毒力强，感染锦鲤、鲤及其普通变种。目前KHV的检测方法大都需要昂贵的仪器设备，且操作复杂，需要专业技术人员操作，不能满足现场快速诊断的要求。因此，目前亟需建立一种操作简单、结果准确可靠、结果判定直观、成本低廉的现场快速检测方法，为疾病的防控提供技术支撑。本论文对锦鲤疱疹病毒病的国内外流行现状、检测方法以及交叉引物技术的原理和应用等进行了阐述，研究与建立了一种与胶体金标记的核酸快速检测试纸条相结合的锦鲤疱疹病毒单交叉引物等温扩增的可视化检测方法。
　　本论文研究的主要内容如下：
　　1.引物设计及病毒DNA重组质粒的构建。根据锦鲤疱疹病毒（Koi herpes virus，KHV）保守的DNA聚合酶（DNA polymerase，Sph）基因，设计了一组单交叉扩增引物，包括交叉引物2a1s，探针引物2 a（2a-Bio）、3a（3a-FIT），剥离引物4s、5 a。利用锦鲤鳍条组织细胞系Koi-Fin培养增殖KHV，提取病毒基因组DNA。以4s、5a为引物和KHV基因组DNA为模板扩增KHV Sph基因的部分片段，然后将该基因片段克隆连接 pMD?-19T载体构建重组质粒pMD?-19T-Sph，作为后续实验的标准DNA模板。
　　2.建立交叉引物等温扩增（cross priming amplification，CPA）的基础反应体系及反应条件，并对其进行了优化，最终建立了KHV单交叉引物等温扩增（single cross priming amplification，SCPA）KHV-SCPA方法。本实验依次优化了引物浓度比例、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Betaine浓度、Bst DNA聚合酶用量以及反应温度和扩增时间。最佳反应体系各成分终浓度为：1×ThermoPol? Reaction Buffer，交叉引物2a1s1.0μmol/L，探针引物2a（2a-Bio）、3a（3a-FIT）各0.5μmo l/L，剥离引物4s、5a各0.6μmol/L，Mg2+浓度8.0 mmol/L，dNTPs浓度1.2 mmol/L，Betaine浓度0.7 mol/L，Bst DNA聚合酶用量5.6 U，模板DNA1μL，无核酸酶水补足至25μL。最佳反应温度为63℃，最佳扩增时间为60 min，扩增产物经凝胶电泳呈现梯形条带。
　　3.KHV-SCPA特异性检测及灵敏度测定。提取锦鲤疱疹病毒KHV、鲤疱疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）、鳗鲡疱疹病毒（AngHV）、大鲵虹彩病毒（GSIV）、白斑综合征病毒（WSSV）以及细菌病原嗜水气单胞菌（Ah）基因组DN A，进行特异性检测实验，结果表明，KHV-SCPA检测方法可特异性检测出KHV。将常规PCR的检测灵敏度与本研究建立的KHV-SCPA检测灵敏度进行比较，结果表明，KHV-SCPA检测方法灵敏度较之常规PCR法高出约1000倍。与胶体金标记的核酸快速检测试纸条相结合，在3~5min内可对等温扩增反应产物进行可视化检测。
　　综上所述，本研究建立的KHV-SCPA检测方法可在63℃下60 min内实现DNA扩增，特异性地检测出KHV，灵敏度较之常规PCR方法高出约1000倍。结合核酸试纸条检测技术，在3~5 min内可对反应产物进行可视化检测。KHV-SCPA检测方法不依赖昂贵的仪器设备与专业技术人员，可应用于锦鲤疱疹病毒的现场快速检测中，为锦鲤疱疹病毒病的准确快速诊断和有效防控提供了技术支撑。

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引言

第一章 文献综述

1 锦鲤疱疹病毒病的研究进展

2 交叉引物等温扩增（CPA）技术原理及应用

3 本论文研究的目的与意义

第二章 锦鲤疱疹病毒Sph基因标准质粒的构建

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 锦鲤疱疹病毒单交叉引物等温扩增检测体系的建立与优化

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第四章 核酸试纸条可视化检测

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

附录一

附录二

致谢