基于时间点的转录组综合分析鉴定斑马鱼下颌再生的调节通路

摘要

组织再生一直是许多生物研究者所研究的重要课题，实现组织和器官的再生也是人类长久以来的梦想。如今再生医学越来越关注于干细胞为基础的再生治疗，最吸引人的策略是能够把可用的细胞转化为需要的细胞类型。为了实现这个目标，需要了解低等动物相应组织的再生过程中的分子调控机制，来为定向诱导干细胞分化、组织原位诱导再生等提供理论支持。
　　斑马鱼(Danio rerio)具有很强的再生能力，之前的研究表明斑马鱼下颌剪去1/3后能完全再生，其再生方式是通过形成芽基这个中间过程来完成再生。再生的基本过程与以前报道大体相似：在切除约1/3下颌后1-2天，创面形成较完整的愈伤表皮，3-4天出现大量的间充质细胞样的梭形细胞即芽基细胞，第5天开始芽基细胞形态和极性与邻近的组织细胞十分相似，并逐步分化成各种组织，在2个月内完成完全再生。所以确定了剪切后1周内是下颌再生的关键时间段，并确定了四个再生的关键时间点：剪切前（uncut），再生愈伤上皮起始（2hpa），芽基形成起始（2dpa），芽基再分化起始（5dpa）。但并不清楚下颌再生关键时间点的基因的表达情况，它们是怎样调控再生的进行以及细胞的转化情况。本研究将进一步阐明斑马鱼下颌芽基再生过程中-细胞和分子间的相互作用。
　　通过组织学观察发现剪去的1/3下颌包含了表皮、真皮、下颌骨的前部、下颌骨连接处和一部分肌肉。剪切后24h，新形成的表皮由表层和中间过渡型细胞构成，中间过渡型细胞表现为核固缩、胞质减少或空泡化，其形态介于间充质细胞/有核血细胞和表皮细胞之间。所以我们认为完整的再生表皮涉及外胚层和中胚层来源的细胞的类型转变。
　　为了揭示芽基再生的再生因子和构建机理，我们对四个再生关键时间点进行了转录组测序分析，分别为剪切前（uncut）、愈伤表皮激发（2hpa）、芽基形成起始（2dpa）和芽基重塑（5dpa）。通过差异基因表达分析，发现总共有5118个基因在这四个时期内发生了显著差异（q<0.05）。除去67个基因在所有时期持续表达，2hpa与0hpa相比有2800个差异表达基因，2dpa与2hpa相比有533个差异表达基因，5dpa与2dpa相比有240个差异表达基因。再生起始与维持经典的10条细胞内信号通路MAPK，ErbB，Wnt，Notch，Hedgehog，TGF-beta，VEGF，ECM-receptor interaction，Cell adhesion molecules和Jak-STAT在斑马鱼下颌再生过程中也都存在。但显著富集之后，只剩余10条中的4条涉及下颌再生，说明调控斑马鱼下颌再生的机制是不同的，需要继续寻找下颌再生关键的信号通路。
　　通过GO富集和功能聚类分析，不仅确定了一些与RNA加工、转录调控、GTP结合蛋白激酶、跨膜转运体、钙离子通道相关的GO条目，而且还发现有10个超家族Fox，Sox，Pax，POU，Six，Hox，Wnt，Bmp，Fgf和Collagen，共富集了101个差异基因，这些基因涉及诱导信号、芽基范围信号、组织特异信号、构造基因。并且发现研究重点要关注于：氧化机制、血管新生、跨膜转运体、GTPase-酪氨酸激酶激活、DNA复制、神经嵴细胞的迁移、细胞分化、轴突的延伸、表皮和肌肉发育的相关基因。
　　通过欧氏距离聚类分析，发现了4条信号通路调控下颌再生，即foxi1-foxo1b-pou3f1，pax3a-mant3a-col11/col2，pou5f1-cdx4-kdrl和isl1-wnt11 PCP-sox9a。而且这些信号通路都直接或间接的与Rho-GTPase和MAPK信号通路有关。免疫组化和转基因鱼的实验结果显示，这些信号通路分别调控愈伤表皮形成，细胞类型的转变，芽基血管的再生和软骨基质的定向。Foxi1-morpholino敲降Foxi1会导致Foxo1b和Pax3a在基底层和芽基交汇处表达的区域扩大，也会影响芽基血管生成。结果表明，Foxi1不仅仅影响表皮外胚层的规格，也同样影响芽基的形成。而且胚胎注射foxi1-Mo会导致sox9a和hoxa2b在胚胎咽弓的表达增加，与下颌中敲降foxi1导致表达Foxo1b和Pax3a的细胞扩散相一致。表明，表达sox9a和hoxa2b的腮弓细胞的区域，需要foxi1来进行下调限制。因此，Foxi1对于形成正确组织构造，包括愈伤上皮和芽基的形成是必须的。本研究对芽基再生过程提供了一个新的见解，即其要涉及表皮细胞的转分化、血管的构建以及软骨基质的沉积。

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第一章 引言

1.1 组织再生的定义与机制

1.2芽基再生（blastemal regeneration）

1.3斑马鱼与其下颌再生

1.4本研究的目的与意义

第二章 斑马鱼下颌再生过程中愈伤表皮与芽基的形态学研究

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3结果

2.4讨论

第三章 下颌芽基再生关键时间点的转录组测序分析

3.1实验材料

3.2方法

3.3结果

3.4讨论

第四章四条信号通路在蛋白和细胞水平的验证

4.1实验材料

4.2实验方法

4.3结果

4.4讨论

第五章信号通路之间的联系

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3结果

5.4讨论

小结

参考文献

附录

致谢