金钱鱼MHC II类基因结构、多态性与组织表达分析

摘要

金钱鱼(Scatophagus argus)为广温、广盐性鱼类，广泛分布于太平洋地区的海水中。因其环境耐受力强，已成为近年来在中国南部深受欢迎的优质海水经济鱼类。为探究金钱鱼MHC II类基因的结构与特性，本研究采用同源克隆和RACE等技术，在获得金钱鱼MHC IIα和β基因cDNA全序列的基础上，分析其内含子序列、基因多态性和感染细菌前后的组织表达情况，为今后金钱鱼抗病基因的筛选以及抗病育种提供依据。 本研究的主要结果如下： 1、金钱鱼 MHC IIα基因结构、多态性及组织表达分析 采用同源克隆和RACE等技术，获得长度为1319 bp的金钱鱼MHC IIα基因的cDNA全序列(Genebank号:KT005411)，命名为Scar-DXA*01。分析发现：金钱鱼MHC IIα基因与其他硬骨鱼类的结构域类似，由信号肽(SP)、两个结构域(α1、α2)、连接肽、跨膜区及胞质区等结构域组成。它的ORF共编码242个氨基酸，分子组成为C2145H3563N729O895S177，分子量59.56kDa；等电点为5.12。该基因包括4个外显子和3个内含子，外显子1编码58bp的5`-UTR和73bp的信号肽，外显子2编码α1结构域，外显子3编码α2结构域，外显子4编码连接肽、跨膜区、胞质区以及537bp的3`-UTR。内含子1长度为246bp，它把外显子1和外显子2分开；内含子2紧跟着外显子2，长度为590bp；内含子3长度为91bp。所有内含子与外显子的匹配位点均为gt/ag。经Predict Protein预测，金钱鱼MHC IIα基因蛋白质的主要功能位点如下：在α2区发现了一个N-糖基化位点(NVSW)，在α1、α2和 CP/TM/CYT区共发现6个 N-豆蔻酰基化位点(GCSDSD、GVQVTE、GTSTNV、GVGPAV、GLGLTD和GVAAGT)，在α2区发现了3个蛋白激酶C-磷酸化位点(SFR、TSR、TVR)，在α1和α2区共有4个酪氨酸激酶II-磷酸化位点(SQHE、SDSD、SFID和SRLE)。 从43尾健康鱼的209个阳性克隆中，获得209条不同编码的核苷酸序列，都包含完整的SP、α1和α2结构域，CP、TM及CYT，分别编码163条不同的氨基酸序列。根据等位基因命名规则，可将它们归为40个等位基因主型及94个等位基因亚型，分别命名为 Scar-DXA*0101~Scar-DXA*4001(GenBank号:KT176102~KT176141)。 分析数据得知，金钱鱼MHC IIα基因的核苷酸序列中有143个变异位点，变异率达20.46%，其中简约信息位点有112个；而氨基酸序列中有69个变异位点，变异率达29.61%，其中简约信息位点有54个。另外，金钱鱼MHC IIβ基因的单倍型多样度(HD)、平均核苷酸差异数目(K)和核苷酸多样度(PI)分别为1.000、45.219和0.065。 RT-PCR检测发现，金钱鱼MHC IIα基因在所检测的11种组织中均有表达，其中在皮、肠、脾、肌和鳃中的表达量较高，中等程度表达于胃、脑、心和肾等组织，而在肝和眼中的表达量较低。人工感染嗜水气单胞菌后，MHC IIα基因在不同实验时间段内，于肠、皮、肝、肾、鳃、脾等组织中的表达量均发生不同程度的变化：肠、脾、皮、鳃和肾组织的表达量在不同时间点呈现波动情况，且均低于对照组；肝组织在24h~48h中的表达量低于对照组，但在12h、72h的表达量却明显高于对照组。 2、金钱鱼 MHC IIβ基因结构、多态性及组织表达分析 采用同源克隆和RACE等技术，获得长度为1172 bp的金钱鱼MHC IIβ基因的cDNA全序列(Genebank号:KT176142)，命名为Scar-DXB*01。分析表明：金钱鱼MHC IIβ基因与其他硬骨鱼类的结构域类似，由信号肽(SP)、两个结构域(β1、β2)、连接肽、跨膜区及胞质区等结构域组成。它的ORF共编码249个氨基酸，分子组成为C2239H3730N750O934S198，分子量62.45kDa；等电点为5.09。该基因包括6个外显子和5个内含子，外显子1包括34bp的5`-UTR和55bp的信号肽，外显子2编码β1结构域，外显子3和4编码β2结构域，外显子5和6编码连接肽、跨膜区、胞质区以及388bp的3`-UTR。内含子1长度为216bp，它把外显子1和外显子2分开；内含子2紧跟着外显子2，长度为1010bp；内含子3把β2结构域分开，长度为85bp；内含子4和5长度分别为258bp和94bp。所有内含子与外显子的匹配位点均为gt/ag。经Predict Protein预测，金钱鱼MHC IIβ基因蛋白质的主要功能位点如下：在β1区发现了一个N-糖基化位点(NSTE)，在β1、β2区和CP/TM/CYT区发现4个N-豆蔻酰基化位点(GNFVGY、GLMYAE、GQEVTS、GLILGL)，在β2区、CP/TM/CYT区发现了3个蛋白激酶C-磷酸化位点(TPR、SLK、SER)，在β2区和CP/TM/CYT区共有5个酪蛋白激酶II-磷酸化位点(SVFD、TSTD、SHLE、TDWD、SMPE)，在β1区存在一个酪氨酸激酶磷酸化位点(KVEDVGY)。 从43尾健康鱼的209个阳性克隆中，获得209条不同编码的核苷酸序列，都包含完整的SP，β1和β2结构域，CP、TM及CYT，分别编码179条不同的氨基酸序列。根据等位基因命名规则，可将它们归为48个等位基因主型及96个等位基因亚型，分别命名为 Scar-DXB*0101~Scar-DXB*4801(GenBank号:KT176142~KT176189)。分析得知，金钱鱼MHC IIβ基因的核苷酸序列中有183个变异位点，变异率达25.74%，其中简约信息位点有139个；而氨基酸序列中有83个变异位点，变异率达35.02%，其中简约信息位点有62个。另外，金钱鱼MHC IIβ基因的单倍型多样度(HD)、平均核苷酸差异数目(K)和核苷酸多样度(PI)分别为1.000、57.480和0.081。 RT-PCR检测发现，金钱鱼MHC IIβ基因在所检测的11种组织中均有表达，其中在脾、鳃、肠和皮肤中表达量较高，中等程度表达于肾、胃、心，而在眼、脑、肝、肌肉中表达量较低。对健康金钱鱼人工感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)后，发现其MHC IIβ基因在肝、脾、鳃、肾、皮和肠等组织中的表达量均发生了不同程度的变化：鳃、肠和脾组织的表达量，在12h~48h均低于对照组的表达量，但在72h的表达量却明显高于对照组；肾和皮组织的表达量在不同时间点呈现波动情况，且均低于对照组；肝组织在12h~24h中的表达量低于对照组，但在48h~72h的表达量却明显高于对照组。