环境胁迫应答因子SigB影响单增李斯特菌生物被膜形成的初步机制研究

摘要

民以食为天，食以安为先。经过改革开放30多年的发展，与食品相关的上下游行业逐步形成独立的食品产业体系，成为集三产为一体的国民经济支柱产业。然而，进入21世纪以来，我国食品安全事件多发、频发，不仅对产业发展造成影响，也给人民身体健康和安全带来威胁，成为社会关注的重大民生问题。由微生物引起的食源性疾病是影响食品安全最主要的因素之一。食品链中，食品加工表面通常较潮湿且富含营养物质，这就给微生物形成生物被膜提供了良好的环境条件。由于膜状态的细菌耐受性增强，使得常规杀菌方法不能有效彻底地灭菌，给食品安全造成极大的隐患。因此，预防和控制细菌生物被膜的形成刻不容缓。 单增李斯特菌是最常见的重要食源性致病菌之一，易在不锈钢片、玻璃及聚苯乙烯等食品加工材料表面聚集形成生物被膜。目前，单增李斯特菌生物被膜的研究主要集中在：（1）外界环境条件(温度、营养、食品接触表面材料)对生物被膜形成的影响。（2）比较不同来源或血清型的单增李斯特菌分离株的生物被膜形成能力。（3）比较单增李斯特菌原始菌株与突变株生物被膜形成能力，研究其生物被膜形成相关基因及分子形成机制。近年来，利用生物信息学手段深入研究细菌生物被膜形成的机理越来越受到关注。单增李斯特菌能广泛存在于土壤、污水、动物性食品及饲草等环境中，这与其内部环境调节因子σ家族有密切关系。其中σ家族中的σB因子是最重要的环境调控因子。虽然已有研究表明单增李斯特菌环境胁迫应答因子 sigB与其生物被膜形成相关，但其具体的形成机制仍不清楚。从单基因水平研究细菌生物被膜形成的分子机制，对揭示其致病机理具有重要的意义。 综上所述，本研究以单增李斯特菌原始菌株WaX12与sigB缺失突变株WaX12-△sigB为材料，探究⑴比较分析不同物理化学条件下，WaX12菌株与WaX12-△sigB菌株生物被膜形成的特性，为后续研究环境胁迫应答因子 sigB影响单增李斯特菌生物被膜形成过程中的分子机制奠定一定的理论基础；⑵利用转录组学技术初步分析单增李斯特菌主要环境胁迫应答因子 sigB影响其生物被膜形成的分子机制，进而深入揭示单增李斯特菌的致病机理，为有效预防和控制单增李斯特菌生物被膜的形成提供新的思路和理论依据。本研究主要研究内容和研究结果如下： 1.不同培养条件下sigB对单增李斯特菌生物被膜形成的影响 本研究比较分析了不同温度(4℃、15℃、25℃和37℃)、pH(4、5、6和7)及NaCl浓度(0.5%、2.5%、4.5%和6.5%)对单增李斯特菌野生型菌株(WaX12)及sigB缺失突变型菌株(WaX12-△sigB)生物被膜形成能力的影响。结果表明，相比于 WaX12菌株，WaX12-△sigB菌株生物被膜的形成量显著降低(p<0.05)。变异系数分析显示，不同培养条件对WaX12菌株及WaX12-△sigB菌株生物被膜形成能力均有影响，其中温度的影响最大，NaCl浓度次之，pH最弱；且WaX12-△sigB菌株生物被膜形成能力更易受到培养条件的影响。其次，分别选取了 WaX12菌株与 WaX12-△sigB菌株生物被膜形成量差异最显著的培养条件(37℃、pH6及2.5%NaCl)进行后续分析。结果发现WaX12-△sigB菌株胞外多糖及胞外蛋白的相对含量均显著降低(p<0.05)，而其活菌数略有降低。本研究为深入探讨 sigB参与单增李斯特菌生物被膜形成的分子机制提供科学依据。 2.乳酸钠协同条件下sigB对单增李斯特菌生物被膜形成的影响 本研究初步分析了不同浓度乳酸钠(0%、2.5%、5%、10%和20%)对单增李斯特菌野生型菌株(WaX12)及 sigB缺失突变型菌株(WaX12-△sigB)生物被膜形成的抑制效果，发现在5%乳酸钠协同作用下，WaX12菌株与WaX12-△sigB菌株生物被膜形成量存在显著差异(p<0.05)，进而探究发现该协同条件下，WaX12-△sigB菌株生物被膜结构较稀疏、胞外多糖和胞外蛋白、膜内细菌细胞活性及细胞膜完整性降低，实时定量PCR结果进一步显示，WaX12-△sigB菌株与鞭毛运动性和合成相关的基因表达量降低更为显著。 3.环境胁迫应答因子sigB影响单增李斯特菌生物被膜形成的分子机制 本研究从转录组学水平分析环境胁迫应答因子 sigB影响单增李斯特菌生物被膜形成的分子机制，采用 GO、KEGG、COG功能注释，对两样本(WaX12菌株与 WaX12-△sigB菌株生物被膜态)间的差异表达基因进行生物功能和分类汇总分析。统计结果显示，两样本间共有2847个基因发生变化，其中，有701个基因具有显著性差异，417个基因功能不明(59.5%)，上调的基因约占55.92%，下调的基因约占44.08%。GO数据库分析结果表明两样本间差异基因主要富集于生物学过程(如核糖体生物合成等)与分子功能(如核糖体的结构组成等)。COG注释分析结果显示，差异基因主要富集于氨基酸运输和代谢(8.9%)、碳水化合物运输和代谢(12.2%)。利用KEGG数据库对两样本转录测序结果进行代谢途径注释，分析结果发现在差异表达基因中注释到74条不同的代谢通路，其中，两样本间的核糖体代谢和戊糖代谢具有显著性差异。

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第一章 绪论

1. 单增李斯特菌简介

2．环境胁迫应答因子SigB简介

3. 生物被膜的研究现状

4. 单增李斯特菌生物被膜研究概况

第二章 不同培养条件下sigB对单增李斯特菌生物被膜形成的影响

1. 引言

2.材料与方法

3. 结果

4. 讨论

5. 本章小结

第三章 乳酸钠协同条件下，sigB对单增李斯特菌生物被膜形成的影响

1. 引言

2.材料与方法

3. 结果

4 讨论

5. 本章小结

第四章 环境胁迫应答因子SigB影响单增李斯特菌生物被膜形成的分子机制

1. 引言

2.材料与方法

3. 结果

4. 讨论

5. 本章小结

全文总结

参考文献

攻读硕士学位期间取得的科研成果

1. 发表中英文文章

2. 会议论文

致谢