大菱鲆C-型和Lily型凝集素基因的克隆、表达及功能研究

摘要

大菱鲆C-型凝集素（SmLec1）和Lily型凝集素（SmLTL）都是重要的免疫因子，具有重要的生理、生化及免疫功能，本文通过基因克隆、组织表达和蛋白重组等方法分析这两种凝集素的活性特点，以及环境胁迫对其表达调控的影响，探讨这两种凝集素在大菱鲆先天免疫应答过程中的潜在功能以及养殖环境中的应用具有重要的意义。 1通过 SmLTL的基因克隆、结构分析和组织表达，对其特性进行分析，为大菱鲆Lily型凝集素的进一步研究奠定理论基础。通过RACE技术克隆得到大菱鲆Lily型凝集素的cDNA全长为569bp，包括编码112个氨基酸的336bp开放阅读框。根据组织的qPCR分析显示，SmLTL mRNA的于皮肤，鳃，肠的表达量显著，在其他组织的表达量不显著。通过生物信息软件随其进行分析，结果显示：SmLTL在第30-99个氨基酸处有两个个甘露糖结合位点（QxDxNxVxY）和一个特殊位点 TxTxGxRxV形成一个β-棱镜架构（x是任何氨基酸残基1）。对SmLTL的一级，二级和三级结构进行了预测，并通过生物工程软件进行分析，显示SmLTL蛋白质是亲水性蛋白，含有5.36％α-螺旋，39.29％延伸链，16.07％β-折叠和39.29％无规卷曲，有三个反式β-折叠，3个蛋白结合位点。 2本研究通过环境胁迫实验、蛋白重组和凝集实验，对 SmLTL的功能展开深层次的研究，为大菱鲆疾病预防和控制新途径打下基础。通过环境胁迫对SmLTL表达水平的调控实验（包括高温和盐度），结果显示皮肤、肠和鳃具有显著的变化。重组SmLTL蛋白在大肠杆菌系统中能够凝集小鼠血细胞且没有钙依赖性，在D-甘露糖存在的情况下被抑制。另外，SmLTL表现出对爱德华氏菌和鳗弧菌的凝集活性。同时SmLTL对纤毛虫具有杀伤性作用，浓度为100μgml-1在24小时后能致死60%的的纤毛虫。同时我们发现感染纤毛虫后的SmLTL的鳃、皮肤和肠的mRNA表达量显著增加。 3通过对大菱鲆C-型凝集素进行环境胁迫实验、蛋白重组和凝集实验，进一步了解其功能特性，为大菱鲆 C-型凝集素在实际生产和养殖中的应用作为理论性指导基础。实验利用原核表达系统进行重组表达，并通过纯化获得重组目的蛋白，活性分析结果显示：重组 C-型凝集素在所选6种细菌中对鳗弧菌和爱德华氏菌具有明显的凝集作用；在选取的8种糖中木糖、果糖、蔗糖、乳糖和甘露糖能够抑制SmLec1的凝集活性；理化因子PH和温度均对SmLec1的凝集活性产生影响；鳗弧菌感染实验显示，感染6h时SmLec1表达量明显上升，在12h时达到最高值，随后有所下降；温度胁迫时肝组织的SmLec1mRNA表达量受到温度的影响显著，在19℃开始升高，22℃到27℃呈降低趋势，其他组织变化不显著。盐度胁迫时SmLec1在各盐度的表达量变化不显著。研究结果表明，SmLec1能够抑制鳗弧菌的感染，其表达受到温度的影响，本研究将为进一步研究大菱鲆C-型凝集素蛋白的抗菌机理和探索对大菱鲆疾病的免疫学防治途径提供科学依据。 大菱鲆C-型和Lily型凝集素是重要的免疫因子，本文通过分析其活性特点，并且首次通过大菱鲆环境胁迫对这两种基因表达调控的影响分析实验，探讨这两种凝集素在大菱鲆先天免疫应答过程中的潜在功能以及养殖环境中的应用。

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引言

第一章 综述

第一节鱼类养殖环境中的主要胁迫因子

第二节 凝集素的研究简史

第三节 凝集素的分类

第四节 凝集素在大菱鲆养殖中的重要意义

小结

第二章、大菱鲆Lily型凝集素基因的克隆、表达和蛋白结构分析

2.1 前言

2.2材料和方法

2.3实验结果

2.4讨论

第三章大菱鲆Lily型凝集素的蛋白纯化和功能分析

3.1前言

3.2 材料和方法

3.3实验结果

3.4讨论

第四章环境胁迫对大菱鲆C-型凝集素功能的影响

4.1前言

4.2材料与方法

4.3实验结果

4.4 讨论

结论

参考文献

硕士期间科研产出情况

致谢