哲罗鲑胰岛素样生长因子-I的原核表达、生物活性鉴定及组织表达分析

摘要

胰岛素样生长因子-I（Insulin-like growth factor-I，IGF-I）是有胰岛素样代谢和促进细胞增殖功能的多肽，有调节鱼类生长发育的作用。哲罗鲑（Hucho taimen）又名哲罗鱼，属鲑形目（Salmoniformes）、鲑科（Salmonidae）、哲罗鱼属（Hucho），是我国珍贵的冷水性鱼类。目前很少见到有关于哲罗鲑 IGF-I的研究报道。 本研究利用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法，从哲罗鲑肝组织的总RNA中获得胰岛素样生长因子-I（IGF-I）的cDNA开放阅读框（Open reading frame，ORF）序列，运用软件对其进行生物信息学分析，并运用实时荧光定量PCR技术检测了哲罗鲑成鱼各组织中IGF-I mRNA的表达情况。结果显示，IGF-I的cDNA开放阅读框为573 bp，编码190个氨基酸，蛋白质等电点为9.21，氨基酸由信号肽、B、C、A、D结构域及 E肽构成；氨基酸序列与鲑科鱼类具有较高的同源性，且与北极红点鲑的IGF-I同源性最高（99.2%）；组织表达检测结果表明，哲罗鲑肝组织中的IGF-I mRNA表达水平最高，在鳃、前肠中次之，在脑、头肾、脾、心、胃和肌肉等中的表达水平较低。 本研究同时又将所得的哲罗鲑IGF-I片段与原核表达载体pS连接，以获得重组表达质粒（IGF-I/pS），并将其转入宿主大肠杆菌Rosetta后经IPTG诱导得到哲罗鲑IGF-I重组蛋白。通过SDS-PAGE电泳，发现在35~50 kDa之间有条带与预期相符，且目的蛋白以包涵体的形式存在。包涵体经变性/复性实验后，得到纯化的IGF-I重组蛋白。ELISA实验结果表明，目的蛋白能特异性识别抗鱼类IGF-I抗体，说明获得了具免疫活性的哲罗鲑IGF-I蛋白。细胞增殖实验（MTT法）结果显示，重组IGF-I蛋白对大麻哈鱼胚胎细胞（CHSE-214）、鲤鱼上皮细胞（EPC）及虹鳟性腺细胞（RTG-2）均有显著促增殖作用，表明得到的 IGF-I融合蛋白具有细胞水平的生物活性。用具有生物活性及免疫学活性的IGF-I融合蛋白处理CHSE-214细胞，并运用Real-time PCR检测试验后IGF-I、IGF-II、GH及 IGF-I受体等基因的相对表达量。结果显示加入哲罗鲑 IGF-I融合蛋白后，CHSE-214细胞中IGF-I、IGF-II、IGF-I Ra和IGF-I Rb基因相对表达量都有所增加,且呈显著性变化。 本研究在基因水平上为鱼类 IGF-I的研究及哲罗鲑的生长发育提供一定的研究基础。同时为深入了解IGF-I在哲罗鲑繁殖发育中的调控作用及绿色促生长制剂的研发提供科学依据。

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引言

第一章 文献综述

1. 鱼类IGF的结构及功能

1.1 IGF的结构

1.2 IGF-I的功能

2. 鱼类IGF的受体及结合蛋白

3. 鱼类IGF的制备技术

4. 哲罗鲑的研究现状

第二章 哲罗鲑胰岛素样生长因子-I（IGF-I）cDNA分子克隆、序列分析及组织表达

1 实验材料

1.1 实验用鱼

1.2 仪器

1.3 试剂用品

1.4 试剂配方

2 实验方法

2.1 引物设计与合成

2.2 IGF-I基因克隆

2.3 IGF-I基因的序列分析

2.4 IGF-I组织表达情况分析

3 结果与分析

3.1 哲罗鲑IGF-I基因片段的克隆

3.2 哲罗鲑IGF-I基因的氨基酸结构分析

3.3 哲罗鲑IGF-I基因序列的系统进化分析

3.4 哲罗鲑IGF-I的组织表达分析

4 讨论

第三章 哲罗鲑胰岛素样生长因子-I的原核表达及活性鉴定

1实验材料

1.1实验用鱼

1.2仪器

1.3试剂用品

2 实验方法

2.1 引物设计与合成

2.2 IGF-I基因的克隆

2.3 IGF-I/pS重组表达质粒的构建

2.4 重组IGF-I蛋白的表达

2.6 IGF-I蛋白免疫学检测

2.7 IGF-I蛋白生物活性检测

2.8 IGF-I蛋白细胞水平实验

3 结果与分析

3.1 IGF-I基因的克隆

3.2 IGF-I/pS重组质粒的构建

3.3 重组IGF-I蛋白在E.coli Rosetta中的表达

3.4 重组IGF-I蛋白的纯化

3.5 IGF-I蛋白的免疫学鉴定

3.6 IGF-I蛋白的生物活性鉴定

3.7 IGF-I蛋白细胞水平实验

4 讨论

4.1 蛋白的诱导表达分析

4.2 蛋白的定性及生物活性分析

结论

参考文献

硕士研究生期间发表的论文

致谢