钙离子浓度对三角帆蚌外套膜和内脏团细胞内钙含量及碳酸酐酶的影响

摘要

三角帆蚌（Hyriopsiscumingii）是我国重要的淡水育珠蚌，是我国珍珠产业的首选贝类。珍珠光滑有光泽，但实际出的珍珠良莠不齐，关键是珠质沉积所致。。而珠质的主要成分为碳酸钙（CaCO3）。为了探究形成碳酸钙结晶的钙离子在体外的来源，在体内的转换、转运及合成，本实验一方面使用流式细胞术结合钙离子探针检测在插核120天期间不同时期内不同钙离子浓度环境下外套膜和内脏团细胞吸收钙离子并滞留细胞的含量；另一方面检测相应情况下三角帆蚌α-碳酸酐酶基因（HcCA）表达量、蛋白表达量和总碳酸酐酶酶活性。最后对插核120天后不同钙离子浓度下培养的三角帆蚌取珠分析珍珠表面沉积状况，旨在探讨HcCA的基因表达、蛋白表达量及酶活性探讨其与三角帆蚌外套膜和内脏团细胞内钙离子含量与其HcCA的基因表达、蛋白表达量及酶活性之间的关系。主要结果如下： 1. HcCA在插核后在内脏团和外套膜中的基因表达量分析及Western Blot蛋白分析 （1）研究发现，在每一个取样的时间节点，0 mM与0.5 mM浓度处理组的HcCA表达量均处于较低水平，第20天，随着Ca2+浓度上升HcCA表达量也逐步上升(P<0.05)，50天、90天、120天1.25 mM、2 mM的HcCA表达量显著高于其他浓度处理组（P<0.05）。当Ca2+浓度升高到3 mM时HcCA表达量均出现不同程度显著下降(P<0.05)。从每个浓度角度分析发现，50天时的 HcCA表达量也显著高于其他浓度组。所有HcCA基因表达都显示，外套膜中HcCA基因表达量显著低于相应时期和浓度下的内脏团表达量（P<0.05）。 （2）Western Blot实验结果验证了HcCA基因在不同浓度不同时期的表达量 2.三角帆蚌外套膜和内脏团细胞内钙离子含量的流式细胞仪检测分析 （1）本实验将培养4个月后的三角帆蚌外套膜和内脏团组织加入胰酶37度水浴消化后，加入Fluo－4/AM溶液37℃孵育30Min，PBS溶液、胰酶消化液、孵育液均使用CaCl2调节溶液钙离子浓度与培养时水体一致。最后流式细胞仪中用488 mM激发，FLI-H荧光通道收集荧光信号，慢速收集104个细胞。在分析流失数据前应先根据细胞分群设门以排除细菌及消化过度的细胞碎片影响。设门完成后使用FL1-A对FL1-H作图，再次设门以排除未完全消化的非单个细胞。最后用FL1-H对Count作图统计钙离子含量。 （2）本实验用平均荧光强度代表细胞内钙离子含量，流式细胞仪数据统计发现外套膜细胞内钙离子荧光强度在0 mM到2 mM浓度均呈显著上升趋势（P＜0.05），荧光强度在2 mM浓度达到顶峰，而在3 mM浓度出现显著下降（P＜0.05）。内脏团细胞中钙离子荧光强度随浓度变化趋势与外套膜细胞相同，但整体荧光强度大于外套膜细胞，且差异显著（P＜0.05）。 3.三角帆蚌内脏团和外套膜组织中碳酸酐酶活性在不同环境钙离子浓度下差异分析 （1）本实验从培养4个月后不同浓度体系中蚌中取出外套膜和内脏团组织使用含 PMSF的强裂解液提取蛋白随后在分光光度计中依次加入1.9 mL15mMol/LTris-H2S04缓冲液(pH7.6),0.1mL的酶液和1 mL3mMol/L的乙酸对硝基苯酯，室温反应5 min后在348nm处用分光光度计测定其吸光值，以不加酶液的为空白对照，酶活定义为:在室温下，每分钟水解1μmol乙酸对硝基苯醋所需的酶量为一个酶活单位.最后比上测得的样品蛋白含量，作为单位酶活性。 （2）本研究发现外套膜及内脏团中的碳酸酐酶活性在环境钙离子浓度为0 mM-0.5 mM时，均显著高于1.25 mM-3 mM环境浓度的活性（P＜0.05）。并且1.25 mM、2 mM、3 mM环境浓度浓度的碳酸酐酶活性差异是不显著的（P>0.05）。此外，研究发现外套膜中的碳酸酐酶活性均显著高于内脏团（P<0.05），同样是0.5 mM浓度处理组酶活性最高（P<0.05），但3 mM处理组酶活性高于1.25 mM、2 mM浓度处理组（P<0.05）。 4.不同环境钙离子浓度养殖下三角帆蚌珍珠质沉积的观察与研究 本研究用扫描电镜分析珍珠表面形态结构发现在外套膜插核育珠180天后，当钙离子浓度为0 mM时，会出现不规则的碳酸钙沉积；当钙离子浓度高于0.5 mM，碳酸钙在珠核上的沉积越来越规则而紧密；当浓度达到3 mM时，表面变得粗糙，规则多边形的沉积结构开始消失。在内脏团插核育珠180天后的珍珠电镜结果显示，无论是高浓度还是低浓度的钙离子环境，碳酸钙的沉积都非常不规则，珍珠表面不平整，容易出现裂痕。

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第一章 引言

1.1软体动物的矿化系统与珍珠的形成

1.1.1软体动的矿化机理

1.1.2软体动物的矿化系统

1.1.3珍珠形成相关理论的研究

1.2三角帆蚌养殖育珠条件的探索

1.2.1 pH值对三角帆蚌珍珠形成的影响

1.2.2温度对三角帆蚌珍珠形成的影响

1.2.3 Ca2+对三角帆蚌生理机能和珍珠形成的影响

1.2.4 Mg2+对三角帆蚌珍珠质沉积的影响

1.3与珍珠形成相关基因研究进展

1.3.1 Ca2+相关基因研究

1.3.2基质蛋白相关基因研究

1.4 研究目的及意义

1.5 研究内容

第二章 三角帆蚌在不同Ca2+养殖条件下外套膜及内脏团细胞钙含量及对碳酸酐酶的影响

2.1 材料和方法

2.1.1 试验材料与试剂仪器

2.1.2 实验方法

2.2结果与分析

2.2.1 HcCA基因表达分析

2.2.2Western Blot实验检测蛋白相对含量

2.2.3 120天细胞内钙离子测定及体外浓度对细胞内钙离子的影响

2.2.4 不同钙离子浓度培养120天后对三角帆蚌碳酸酐酶活性影响

2.3 讨论

2.3.1 不同Ca2+浓度、不同时期的外套膜、内脏团HcCA基因表达变化

2.3.2 不同Ca2+浓度养殖120天后外套膜、内脏团细胞内Ca2+含量变化

2.3.3 碳酸酐酶与细胞内Ca2+含量的关系研究

2.3.4 不同Ca2+浓度养殖三角帆蚌碳酸酐酶活性与基因表达量的关系

第三章 环境Ca2+浓度对三角帆蚌珍珠质沉积的影响

3.1 材料与方法

3.1.1实验材料

3.1.2实验方法

3.2扫描电镜观察结果

3.2.1 外套膜插核珍珠扫描电镜观察结果

3.2.2内脏团插核珍珠扫描电镜观察结果

3.3讨论

小结

参考文献

附录

致谢