一种三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法

摘要

本发明公开了一种三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法，是将三角帆蚌外套膜组织进行原位杂交，根据外套膜组织原位杂交的结果对目的基因进行基因定位，所述的外套膜组织原位杂交所用的探针为针对目的基因的探针，所述的目的基因的序列如SEQIDNo.1所示，所述的探针的序列如SEQIDNo.2所示。本发明为三角帆蚌外套膜参与的成壳和育珠研究提供了基因定位的方法，也为进一步研究三角帆蚌生长和育珠过程中各种分子机制提供了一种技术手段。本发明的方法易于操作，节省时间，无需特殊设备，成本较低。本发明对养殖中提高淡水珍珠质量的研究有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法。

背景技术

三角帆蚌是我国最主要的优质淡水育珠蚌，具有重要的经济价值。育珠蚌的外套膜能分泌物质形成贝壳，还能分泌珍珠质形成珍珠。淡水蚌的蚌壳通常可分为角质层、棱柱层和珍珠层三层结构，而外套膜不同部位的组织细胞具有形成不同贝壳结构的作用。通常认为角质层由外套膜边缘的生壳突起分泌形成，棱柱层由外套膜边缘膜的高柱状细胞分泌形成，珍珠层由外套膜中央膜的柱状细胞分泌形成。优质淡水珍珠中主要含有较厚的珍珠层而含较少的棱柱层结构。因而，研究育珠蚌的外套膜对成壳和育珠的作用对于提高和改善育珠蚌的珍珠质量具有非常重要的意义。

目前，对贝壳和珍珠形成机制的研究主要集中在参与矿化作用的蛋白和多肽的分离及其基因的克隆，而有关基因的功能研究还存在很多困难。研究功能基因的定位，尤其是研究相关基因在参与贝壳和珍珠形成中起重要作用的外套膜中的定位情况，将有助于了解相关基因的功能，揭示其在生物矿化中的作用，从而为提高养殖珍珠的产量和质量提供理论基础。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法，是将三角帆蚌外套膜组织进行原位杂交，根据外套膜组织原位杂交的结果对目的基因进行基因定位，所述的外套膜组织原位杂交所用的探针为针对目的基因的探针，所述的目的基因是三角帆蚌SRCR-1基因，GenBank登录号为accession no. KC691745，其序列如SEQ ID No.1所示，所述的探针的序列如SEQ ID No.2所示。

所述的外套膜组织原位杂交包括以下步骤：

（1）将三角帆蚌外套膜组织进行固定；

（2）将固定好的外套膜组织进行切片；

（3）将组织切片进行预处理；

（4）将预处理后的组织切片进行杂交；

（5）杂交后的处理与检测。

所述的步骤（1）是将三角帆蚌外套膜组织用4%多聚甲醛溶液在温度4℃下固定24 h，然后用DEPC水配制的1×PBS溶液洗涤组织。

所述的4%多聚甲醛溶液的溶质为多聚甲醛，溶剂为PBS，多聚甲醛的终浓度为4%（质量百分含量），所述的PBS的制备方法为：NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na₂HPO₄ 1.44 g、KH₂PO₄ 0.24g，用DEPC-H₂O 配至1 L，调pH值至7.4。

所述的步骤（2）是将固定后的外套膜组织切成厚度为7～10 μm的组织切片，并将烘烤后的切片保存于4℃冰箱。

步骤（3）中所述的预处理按照如下步骤进行：

（a）将组织切片分别进行第一次二甲苯脱蜡5 min、第二次二甲苯脱蜡5 min、二甲苯和酒精的等量混合液脱蜡5 min；

（b）然后依次经过第一次无水乙醇清洗10 min、第二次无水乙醇清洗10 min、95%乙醇清洗5 min、90%乙醇清洗5 min、80%乙醇清洗5 min、70%乙醇清洗5 min、1×PBS溶液清洗10 min；

（c）然后再依次经过Triton X-100清洗10 min、1×PBS溶液清洗10 min、37℃下含5 μg/mL蛋白酶K的PBS溶液清洗15 min、0.2%（质量百分含量）甘氨酸溶液清洗5 min、第一次1×PBS溶液清洗5 min、第二次1×PBS溶液清洗5 min，用4%多聚甲醛溶液滴片固定5 min；

（d）固定后再用1×PBS溶液清洗两次，每次均清洗5 min，组织切片放入55℃去离子甲酰胺和1×SSC的等量混合液中浸泡30 min。

步骤（4）中所述的杂交条件为：杂交液中加入终浓度为1.0 μg/mL的探针，混合均匀，75℃加热5 min后，冰上急冷，然后将杂交液滴片到组织切片上，于55℃的杂交炉中孵育16～20 h。

所述的步骤（5）按照如下步骤进行：

（a）杂交后的组织切片用甲酰胺和1×SSC的等量混合液于55℃下洗涤两次，每次均洗涤30 min；

（b）组织切片用NTE Buffer于37℃下洗涤10 min，然后用加有终浓度为20 μg/mL的RNase A的NTE Buffer溶液于37℃下洗涤30 min，再用NTE Buffer于37℃下洗涤10 min；

（c）分别用1×SSC、0.5×SSC、0.1×SSC于37℃下各洗涤一次，每次均为10 min；

（d）用1×PBS溶液于37℃下洗涤切片5 min，再将组织切片浸入Blocking solution溶液中，室温浸泡1 h，然后浸入1% BSA溶液中，室温浸泡30 min；

（e）按1:2000的抗体效价，在Blocking solution溶液中加入Anti-Digoxigenin-AP抗体，将组织切片浸入其中，室温浸泡2 h；

（f）将经过抗体孵育后的组织切片用Wash solution室温洗涤2次，每次洗涤20 min；

（g）再将切片浸入Detection solution溶液中，室温浸泡3 min；

（h）然后将切片放于NBT/BCIP反应液中避光孵育12～16 h，在此过程中观察切片呈色强度；

（i）当显色完全后，将切片用1×PBS溶液室温清洗10 min；

（j）最后将切片经过二甲苯脱色，用中性树脂封片，观察，拍照。

所述的NTE Buffer的具体成分为：500 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，pH 8.0。

所述的三角帆蚌为健康3龄三角帆蚌。

本发明优点在于：

1、本发明为三角帆蚌外套膜的研究提供了基因定位的方法，为进一步研究三角帆蚌的矿化机制及成珠机理提供了很好的技术手段；

2、本发明的方法易于操作，无需特殊设备，成本较低，技术适应性较好，显色后的组织切片能够清地观察到基因在外套膜中的表达定位情况；

3、本发明对于实际养殖生产中提高和改善淡水育珠蚌的珍珠品质也具有理论意义。

附图说明

附图1是三角帆蚌SRCR-1基因在外套膜中的原位杂交结果×4倍图。

附图2是三角帆蚌SRCR-1基因在外套膜中的原位杂交结果×20倍图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

    实施例1

4%多聚甲醛溶液的溶质为多聚甲醛，溶剂为PBS，多聚甲醛的终浓度为4%（质量百分含量）。所述的PBS的制备方法为：NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na₂HPO₄ 1.44 g、KH₂PO₄ 0.24g，用DEPC-H₂O 配至1 L，调pH值至7.4。所述的DEPC-H₂O的配制方法如下：1000 mL双蒸水中加入1 mL DEPC，磁力搅拌器搅拌过夜，高压灭菌，封闭备用。

Triton X-100为0.3%的工作浓度，溶剂为PBS。0.2%甘氨酸溶液，溶质为甘氨酸，溶剂为PBS，甘氨酸的终浓度为0.2%（质量百分含量）。NTE Buffer的具体组分为：500 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，PH 8.0。1% BSA溶液的制备方法如下：0.5 g BSA溶解于50 mL Blocking solution溶液中。

三角帆蚌为健康3龄三角帆蚌。Triton X-100、蛋白酶K、SSC等试剂购于生工生物工程（上海）股份有限公司。Blocking solution溶液、Wash solution溶液、Detection solution溶液、Anti-Digoxigenin-AP抗体、NBT/BCIP反应液购于Roche公司。

三角帆蚌外套膜目的基因SRCR-1的定位方法，具体步骤如下：

1、制备探针

（a）根据三角帆蚌SRCR-1基因的GenBank序列（如SEQ ID No.1所示），设计特异性引物，SRCR-1的特异性引物如下：

上游引物：5′ - AGTCAATGAGTCTGCACCCG -3′

下游引物：5′ - TCCGTCACACTGAGAAAGGT -3′

（b）将三角帆蚌的SRCR-1基因用设计的引物进行PCR扩增，扩增出214bp的针对SRCR-1基因的探针序列（如SEQ ID No.2所示）；

（c）将PCR产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收；

（d）将回收后的产物于16℃与多克隆位点两端具有T7、SP6启动子的载体进行过夜连接；

（e）将连接好的质粒转化细菌后，于37℃摇菌培养过夜，然后进行测序验证；

（f）测序正确后，经判断确认SRCR-1基因的探针序列插入载体的顺序是正向的；

（g）使用限制性内切酶对质粒进行酶切；

（h）将酶切产物用TIANGEN 胶回收试剂盒进行胶回收；

（i）分别用T7 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶对探针进行体外转录，用地高辛标记，合成正义和反义探针，－80℃保存备用。

2、三角帆蚌的选择和组织固定

选择健康3龄三角帆蚌（壳长>10 cm，壳宽>8 cm），贝壳完整无残缺。将开壳器轻轻插入三角帆蚌的两壳之间，撑开双壳，注意不要破坏外套膜的完整性。用剪刀沿壳边缘向壳顶方向剪取宽0.5 cm、长1 cm的外套膜组织，用DEPC水配制的1×PBS溶液洗涤组织。然后用镊子在滤纸上将组织充分展平拉直，浸泡于4%多聚甲醛溶液中4℃下固定24 h，用DEPC水配制的1×PBS溶液洗涤组织。

3、对固定好的外套膜组织进行切片

将固定后的组织切成厚度为7～10 μm的组织切片，并将烘烤后的切片保存于4℃冰箱。

4、将组织切片进行预处理

（a）将组织切片分别进行第一次二甲苯脱蜡5 min、第二次二甲苯脱蜡5 min、二甲苯和酒精的等量混合液脱蜡5 min；

（b）然后依次经过第一次无水乙醇清洗10 min、第二次无水乙醇清洗10 min、95%乙醇清洗5 min、90%乙醇清洗5 min、80%乙醇清洗5 min、70%乙醇清洗5 min、1×PBS溶液清洗10 min；

（c）然后再依次经过Triton X-100清洗10 min、1×PBS溶液清洗10 min、37℃下含5 μg/mL蛋白酶K的PBS溶液清洗15 min、0.2%（质量百分含量）甘氨酸溶液清洗5 min、第一次1×PBS溶液清洗5 min、第二次1×PBS溶液清洗5 min，用4%多聚甲醛溶液滴片固定5 min；

（d）固定后再用1×PBS溶液清洗两次，每次均清洗5 min，组织切片放入55℃去离子甲酰胺和1×SSC的等量混合液中浸泡30 min。

5、杂交

杂交液中加入终浓度为1.0 μg/mL的探针，混合均匀，75℃加热5 min后，冰上急冷，然后将杂交液滴片到组织切片上，于55℃的杂交炉中孵育16～20 h。

6、杂交后处理与检测

（a）杂交后的组织切片用甲酰胺和1×SSC的等量混合液于55℃下洗涤两次，每次均洗涤30 min；

（b）组织切片用NTE Buffer于37℃下洗涤10 min，然后用加有终浓度为20 μg/mL的RNase A的NTE Buffer溶液于37℃下洗涤30 min，再用NTE Buffer于37℃下洗涤10 min；

（c）分别用1×SSC、0.5×SSC、0.1×SSC于37℃下各洗涤一次，每次均为10 min；

（d）用1×PBS溶液于37℃下洗涤切片5 min，再将组织切片浸入Blocking solution溶液中，室温浸泡1 h，然后浸入1% BSA溶液中，室温浸泡30 min；

（e）按1:2000的抗体效价，在Blocking solution溶液中加入Anti-Digoxigenin-AP抗体，将组织切片浸入其中，室温浸泡2 h；

（f）将经过抗体孵育后的组织切片用Wash solution室温洗涤2次，每次洗涤20 min；

（g）再将切片浸入Detection solution溶液中，室温浸泡3 min；

（h）然后将切片放于NBT/BCIP反应液中避光孵育12～16 h，在此过程中观察切片呈色强度；

（i）当显色完全后，将切片用1×PBS溶液室温清洗10 min；

（j）最后将切片经过二甲苯脱色，用中性树脂封片，观察，拍照。

结果表明：光镜下可见三角帆蚌外套膜各层组织细胞结构完整，特征明显。由图1、图2可见，三角帆蚌SRCR-1基因特异性地表达于外套膜边缘膜的腹膜区以及边缘膜顶端的外折区，可推测三角帆蚌SRCR-1基因参与贝壳棱柱层和角质层的形成。本方法得到的结果图像色彩清晰、对比度适当，可准确对目的基因的表达情况进行定位。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>  上海海洋大学

<120>  一种三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法

<130>  /

<160>  2    

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1000

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

acgcggggag tatctgtggc acgacgaata aattgtacaa cgagaagcag atcaagagaa     60

tggttacatt ttattttata ggcatattgc tgctggtaca tcatgaatca gtttactgtg     120

agtcaccatc aaccacatct acagccgata caaggtccac atacgataca gcaggtacaa    180

cggacaaaga atattctctc aggctagcac atgggaagta tggaatggta gagattaaat    240

tacggaatac ctggggatat atttgtccaa accatttcaa tgacgcagac gctatggtac    300

tgtgccgaga gctgggctac aaaggtgggt tcgcctactt actgatacgc gagtttgata    360

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atggtctcgt ggagatggct atagatggag aatggcgtcc attttgtggc tatcagggct    600

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gtcgcagcgg tttgcttccg accatcaagt gtttttaagg ctaatgactt ccctgcaact    900

ggcatctcca ctttcaatgg atgaaacagc ttgtttagct cgtccacaaa caaatctaat    960

aaagcaaaag cagaagcttc tgctacatga aaaaaaaaaa                         1000

 

<210>  2

<211>  214

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

agtcaatgag tctgcacccg gttatggtct cgtggagatg gctatagatg gagaatggcg     60

tccattttgt ggctatcagg gctttgatta taattccaga gcaattgact acatttgtca    120

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