雌二醇对三疣梭子蟹卵巢发育和雌激素相关受体基因表达的影响

摘要

三疣梭子蟹是我国重要的海水养殖蟹类，池塘养殖三疣梭子蟹卵巢发育不良是困扰该产业的重要问题。雌二醇是甲壳动物体内十分重要的性类固醇激素，在卵巢发育过程中起到十分重要的作用。尽管池塘养殖三疣梭子蟹卵巢发育不良可能与雌二醇(E2)分泌不足有关，但有关于其作用机制所知甚少。本研究首先采用免疫荧光的方法研究了三疣梭子蟹卵巢发育过程中E2在卵巢、肝胰腺、胸神经节、脑神经节和大颚器中的分布及变化规律；此后，通过离体和活体实验研究了 E2对三疣梭子蟹卵巢发育、卵黄蛋白原(Vg)和雌激素相关受体(ERR)基因表达的影响；最后通过RNAi实验初步探讨了ERR基因在三疣梭子蟹卵巢发育过程中可能作用。具体研究结果如下： 1.三疣梭子蟹卵巢发育过程中E2的免疫定位 本研究采用免疫组化的方法系统研究了卵巢发育过程中E2在卵巢、肝胰腺、胸神经节、脑神经节和大颚器中的分布及变化。结果表明：(1)卵巢中 E2的免疫阳性主要分布于滤泡细胞和卵巢发育中后期的卵母细胞胞质(II-V期)，随着卵巢的发育，卵母细胞胞质中的E2免疫阳性呈现出先上升后下降的趋势，而滤泡细胞中则一直存在较强的E2免疫阳性；(2)在肝胰腺(I-IV期)中，E2的免疫阳性主要分布于F细胞及R细胞核中，其最大免疫阳性出现在卵巢发育IV期的肝胰腺中；(3)在神经组织(I-IV期)中，E2主要分布于胸神经团的神经细胞和神经髓质以及脑神经节神经细胞的胞核内，并始终保持着强免疫阳性反应；(4)在大颚器(I-IV期)中，E2强免疫阳性始终存在于大颚器腺细胞的核仁以及核周围的细胞质内。以上结果暗示，卵巢、肝胰腺、胸神经团、脑神经节和大颚器可能是三疣梭子蟹卵巢发育过程中E2的主要作用靶点，不同靶器官间可能存在复杂的相互作用来共同调控卵巢发育。 2. E2对三疣梭子蟹卵巢发育相关基因表达的影响 通过活体注射和离体调控两种手段来研究 E2对三疣梭子蟹卵巢发育、ERR和Vg基因表达的影响。结果表明：(1)对处于卵巢发育III期中期的三疣梭子蟹而言，不同浓度的外源 E2活体注射，对其卵巢指数和肝胰腺指数无显著影响；(2)注射不同浓度的外源E2对卵巢和肝胰腺中ERR和Vg mRNA的表达量有显著影响，主要表现为不同浓度的外源E2可促进卵巢和肝胰腺中Vg-mRNA的表达量显著升高，而ERR-mRNA的表达量则显著下降；(3)在神经组织和大颚器中，不同浓度的外源E2均会降低ERR的表达量，推测E2是通过调节ERR和Vg两种基因的拮抗表达来调控卵巢发育；(4)取卵巢发育处于 III期的三疣梭子蟹的卵巢进行离体调控实验，结果表明10-8mol/L E2可以显著提高卵巢中ERR-mRNA的表达水平。 3.离体条件下三疣梭子蟹ERR RNA干扰体系的建立及其功能的初探 首先通过体外逆转录合成3个不同的ERR dsRNA干扰片段，在26℃的恒温培养箱内，取III期卵巢离体干扰1h、2h、4h、8h，结果发现有一条干扰片段持续有效，干扰片段的浓度为2μg/ml。此后，对卵巢发育处于 III期的卵巢组织进行4种不同处理的离体培养，分别为：2μgGFP dsRNA(A组)、2μg ERR dsRNA(B组)、2μg ERR dsRNA和10-8mol/L的E2联用组(C组)及10-8mol/LE2组(D组)，结果发现，与A组相比，B组和C组中ERR基因的表达量显著下降，而D组ERR基因的表达量显著升高。这说明在本研究中筛选的ERR dsRNA可有效降低卵巢中ERR-mRNA的表达水平，10-8mol/L E2可以显著提高卵巢中ERR-mRNA的表达水平。以上结果表明ERR在三疣梭子蟹卵巢发育的调控过程中起到十分重要的作用，E2可能是通过作用于 ERR的信号通路来调控卵黄发生，相关调控路径还需要进一步深入研究。

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第一章 引 言

1.1 甲壳动物中雌激素的研究进展

1.2 雌激素在甲壳动物卵巢发育过程中的作用

1.3 甲壳动物雌激素的作用机制

1.4 存在问题及展望

第二章 三疣梭子蟹卵巢发育过程中雌二醇的免疫定位

2.1材料与方法

2.2 结果

2.3讨论

第三章 雌二醇对三疣梭子蟹卵巢发育及其相关基因表达的影响

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

第四章离体条件下三疣梭子蟹ERR RNA干扰体系的建立及其功能的初探

4.1实验材料与方法

4.2结果

4.3 讨论

附录第五章 中华绒螯蟹卵巢发育期间两种雌激素受体在卵巢和肝胰腺的分布及变化

5.1材料与方法

5.2 结果

5.3 讨论

参考文献

小结

1. 本研究的主要结论

2. 本研究的创新点

3. 本研究的不足和展望

攻读硕士期间发表的相关论文及专利

致谢