CRISPR/Cas9系统介导的七鳃鳗和斑马鱼基因组编辑方法的建立与优化

摘要

近年来，ZFN(Zinc-finger nucleases)、TALEN(Transcription activator-like effector nucleases)及CRISPR-Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated proteins，成簇的规律性间隔的短回文重复序列及相关的核酸内切酶)等基因编辑技术得到快速发展。在这些技术中，CRISPR-Cas9技术以其简单高效率的特点备受青睐。 七鳃鳗是一种无颌脊椎动物，被誉为生物进化的活化石。通过对七鳃鳗的研究将有助于揭示脊椎动物所特有的形态特征的进化机制，包括神经嵴、脑、咽骨、颌、脊椎和附加器官。传统的对功能基因的研究方法是将携带突变的嵌合突变体通过遗传传代的方式将突变基因遗传给后代，最终通过对纯合突变体的研究来获知该基因的功能。本实验研究对象为东北七鳃鳗（Lethenteron morii），东北七鳃鳗是一种生活在我国东北地区的冷水性水生动物，从出生到成熟需要经历数次变态才能发育成熟，对环境要求比较高。由于七鳃鳗复杂的生活习性使其很难在实验室进行人工养殖，这大大限制了七鳃鳗功能基因方面的研究。 本研究构建了2个七鳃鳗密码子偏好性优化的Cas9-gRNA系统并对五个靶基因golden(gol，Slc24a5)、kctd10、wee1、soxe2、wnt7b进行敲除检测，通过T7E1酶切及PCR产物测序来检测注射后的早期胚胎是否敲除成功及敲除效率。结果发现，所选的五个靶基因都实现了高效的敲除效率。为进一步确认Cas9-gRNA系统的高敲除效率，我们对注射上述五个基因的单胚胎进行单克隆测序。测序结果显示，注射对应敲除基因的胚胎的基因组发生突变的比率分别是68/69、47/56、38/39、36/37、36/42。 通过对注射胚胎的观察，我们发现注射了gol和kctd10两个基因的东北七鳃鳗产生了数量较多的有规律的突变表型。gol是编码钠离子/钙离子交换泵Slc24a5的基因。在斑马鱼中，Slc24a5蛋白影响色素的形成。因此根据视网膜的颜色变化来检测双等位基因破坏情况是一个很方便的标准。另外，kctd10是一个编码钾离子通道四聚体化结构域家族的成员之一。在斑马鱼中，kctd10突变将导致房室管畸形，产生一个拉长的线状的心脏。Kctd10的功能缺失是隐性的，并且突变的表型持续可见。 通过对注射gol和kctd10突变的七鳃鳗幼仔分别进行数量统计发现，gol和kctd10的突变数量所占比例分别为38.6%和85.3%，而T7E1酶切结果和单克隆测序结果均显示gol具有更高的敲除效率。通过七鳃鳗与人、小鼠、斑马鱼同源基因的序列比对发现，敲除gol所选的靶点位于一个不保守的区域，而kctd10的靶位点位于一个保守的区域。因此我们认为将靶点选定在一个功能保守的区域将可以提高表型突变率。综上所述，我们推断CRISPR/Ca9系统介导的基因编辑系统非常高效，这同时也为其他一些很难利用传统遗传手段进行功能基因研究的物种提供了新的研究途径。 Hox基因是一类在早期胚胎发育过程中调控身体形态构建的一大类转录因子家族。当Hox基因产生突变时，往往会导致早期胚胎发育的畸形。无脊椎动物的基因组中只有一个基因簇，而脊椎动物在进化过程中染色体发生加倍过程，最终在四足动物中含有4个Hox基因簇，在硬骨鱼类的斑马鱼中由于基因缺失等原因最终形成了7个Hox基因簇。 本人利用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼Hox基因（簇）进行敲除或片段删除。其中针对单位点所进行的敲除，敲除的靶位点有HoxA2b、HoxB2a、HoxB7a、HoxB10aup、HoxB10a down、HoxB13a、HoxC1a、HoxC3a、HoxC12b和HoxC13b等多个位点，其敲除效率在20%~90%之间；同时针对片段进行的敲除有HoxB10a,、HoxBa、 HoxBb和HoxCb四个基因簇，其片段删除效率分别是2/40、1/30、3/40和0/90。通过对比发现，单位点的敲除效率要远高于片段删除的效率，但是由于样本数量过少我们并没能发现片段删除的长度和片段删除的效率之间的对应关系。这些纯合突变体的获得可以帮助我们解答由于硬骨鱼类染色体加倍而产生的Hox基因簇加倍对硬骨鱼类早期胚胎发育的作用以及硬骨鱼类所特有的Hox基因的具体功能。

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引言

1.1 CRISPR/Cas系统简介

1.2 CRISPR/Cas的分类

1.3 CRISPR/Cas系统的发展历程

1.4 CRISPR/Cas在基因编辑领域的应用

1.5 七鳃鳗简介

1.6 七鳃鳗功能基因的研究进展

1.7 斑马鱼介绍

1.8 Hox基因简介

1.9 大片段敲除方面的研究进展

1.10 科学问题假设及本研究所取得的一些成果

第二章 实验材料与方法

2.1 七鳃鳗和斑马鱼的来源与养殖条件

2.2 所需实验仪器

2.3 实验所需试剂

2.4 实验方法

第三章 CRISPR/Cas9系统介导的七鳃鳗双等位基因敲除方法的建立与优化

3.1实验结果

3.2 讨论

第四章 CRISPR/Cas9系统介导的斑马鱼Hox基因（簇）突变体的制备

4.1 实验结果

4.2讨论

第五章 总结

参考文献

附录

致谢