一种由Crispr/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式及建立方法

摘要

本发明涉及一种由Crispr/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式，该模式是指包含EDA基因外显子4位点碱基插入的鳞片缺失斑马鱼。同时，本发明还公开了该模式的建立方法和应用。本发明建立的鳞片缺失斑马鱼模式在皮肤附件相关基因功能研究、筛选治疗人类头发稀少等外胚层发育不良药物等方面具有很大的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种由Crispr/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式及建立方法。

背景技术

人类及哺乳动物的毛发、牙齿、指甲、汗腺，鸟类的羽毛，鱼类的鳞片、下咽齿、触须等都属于皮肤附件，而皮肤附件的发育对于人类来说至关重要，而且皮肤附件发育不良患者具有家族遗传性，目前在小鼠、鱼等也发现有此类现象，通过遗传学研究已证实，皮肤附件的发育主要由EDA家族基因调控。

Eda (Eetodysplasin) 及受体Edar与TNF相关联，属于TNF超家族成员，EDA信号是通过Eetodysplasin、EDAR、EDARADD来调节，在鱼类到人类的脊椎动物皮肤附件调控中形成了一个TNF配体-受体-适体家族。EDA信号通路首次在人类外胚层发育不良综合症发现。无汗或少汗型外胚层发育不良（EDA）是外胚层发育不良群体中最普遍的一种症状，主要影响两种或更多种皮肤附件的形态发生。

EDA主要影响毛发、牙齿和集中外分泌腺包括汗腺、睑板腺和包皮腺。作为一种遗传学疾病，EDA以X-连锁隐性、常染色体显性和隐性等形式发生。1875年达尔文首次在他的书《The variations of animals and plants under domestication》中描述了X-连锁形式，详细地记录了一个受影响印第安家族皮肤附件的表型和男性特有的遗传模式。100多年以后在病人中发现了三种基因各种形式的变异，其中X-连锁EDA基因突变在案例中占90%以上，其余案例主要是EDAR和EDARADD基因比较罕见的常染色体显性遗传。大量的结果证明EDA、EDAR和EDARADD基因编码了参与皮肤附件发育的TNF配体-受体-适体家族。Eetodysplasin 是一个由X性染色体连锁的EDA基因编码的二型跨膜蛋白，其在细胞外区域包含一个短的胶原部分（collagen）和一个TNF域。在接近collagen区有弗林蛋白酶（furin）位点，产生可溶性的EDA配体，再形成有活性的配体三聚体。目前已经发现在TNF、collagen、furin切割和跨膜位点发生错义或阅读框内的缺失突变，会引起EDA综合症。TNF是Eetodysplasin的功能结构域，然而在病人中发现的一些突变显示，collagen区也有很重要的作用，该区域包含19个G-X-Y重复，在阅读框内的2个G-X-Y重复或4个G-X-Y重复的缺失虽然不影响TNF域的功能，但同样可以导致EDA综合症。比较基因组学和遗传学研究发现人、鼠、鱼、非洲爪蟾、鸡、牛、黑猩猩等EDA、EDAR、EDARADD基因在进化过程中高度保守。

目前发现相似的自发突变动物模型有EDAR突变的青鳉鱼、EDA突变的狗和牛，Tabby, Downless/Sleek 和 Crinkled小鼠突变体。人的EDA基因突变和自然突变的tabby小鼠的表型一致，表现为毛囊数量的下降或缺失以及汗腺管与牙齿发育的缺陷。皮肤附件表现为物种特异性，相对于哺乳动物的毛发、汗腺，鱼类主要是骨板、鳞片等。Colosimo等（2005年）研究发现，在三刺鱼从海洋到淡水的过渡中EDA也参与骨板模式的适应性进化。小鼠的EDA-A1可以使淡水三刺鱼骨板恢复与海洋三刺鱼的一致的模式，进一步指出EDA基因对于皮肤附件平行进化的适应性（可塑性）。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种由Crispr/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供该鳞片缺失斑马鱼模式的建立方法。

为解决上述问题，本发明所述的一种由Crispr/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式，其特征在于：该模式是指包含EDA基因外显子4位点碱基插入的鳞片缺失斑马鱼。

如上所述的一种由Crispr/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式的建立方法，包括以下步骤：

⑴利用Ensemble在线数据库，查找斑马鱼EDA基因序列no：ENSDARG00000074591并下载，在该序列查找PAM序列即5’-GGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG-3’，在EDA基因外显子找到的靶向作用序列为TTAGGCAAGAAAGGGCCCCC【TGG】，并设计并设计突变检测引物F-eda: ttgttttgcttctcatcagttg和突变检测引物R-eda: tttgctctgctgcttcactc；

⑵目标序列的野生型等位基因的测序验证：

随机选取5枚24hpf野生型斑马鱼胚胎，提取基因组DNA模板，然后用F-eda和R-eda进行PCR扩增，得到片段长度为358bp 的PCR扩增产物Ⅰ，该PCR扩增产物Ⅰ以所述突变检测引物F-eda直接测序，以表明目标基因组序列和数据库中的序列一致，无SNP应用重叠；

⑶构建sgRNA：

⑷建立eda-sgRNA模板：

以PCR法获得sgRNA的体外转录的模板，该模板序列如下： TAATACGACT CACTATAGTT AGGCAAGAAA GGGCCCCCgt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt t；

⑸sgRNA体外转录：

以所述PCR扩增产物Ⅰ为模板，用T7 RNA聚合酶进行sgRNA体外转录，得到sgRNA；所述sgRNA经无水乙醇法沉淀后使其浓度为1000ng/ul；

⑹Cas9 mRNA体外转录：

以U7驱动的人源化的Cas9编码序列（Mali et al., 2013. Science, 339(6121):823-6）为模板，用U7 RNA聚合酶进行Cas9体外转录，然后戴帽并加尾，得到Cas9 mRNA；所述Cas9 mRNA经无水乙醇法沉淀后使其浓度为600ng/ul；

⑺斑马鱼受精卵的显微注射及突变检测：

将所述sgRNA与所述Cas9 mRNA等量混合后，显微注入到1~2细胞期的野生型斑马鱼受精卵，待胚胎发育至24 hpf时，取5枚胚胎，制备基因组DNA模板，然后以所述突变检测引物F-eda和所述突变检测引物R-eda进行PCR扩增，得到PCR扩增产物Ⅱ；将所述PCR扩增产物Ⅱ亚克隆到pEASY-T3载体中；并以T7和Sp6通用引物对转化子进行扩增，将PCR产物十个一组共两组直接送测序，测序引物为T7或Sp6其中一条；

⑻突变体鳞片发育观察及染色鉴定：

对检测有EDA 基因突变的斑马鱼的鳞片发育情况进行显微观察，筛选获得EDA基因外显子4靶位点引入插入突变导致鳞片缺失突变体，对鳞片发育异常个体进行鳞片染色鉴定，以确定鳞片是否有发育缺陷。

如上所述的一种由Crisper/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式的应用，其特征在于：该鳞片缺失斑马鱼模式应用于皮肤附件相关基因功能的验证及外胚层发育不良药物的筛选。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明针对斑马鱼EDA基因(含8个外显子)，设计靶向作用于外显子4位点的EDA-sgRNA（见图1），通过构建EDA-sgRNA和Cas9 mRNA载体，反转录后注射受精卵，经PCR扩增及测序验证检测到在外显子4位点引物12个碱基的插入突变（见图2）。

2、本发明对EDA基因插入突变的个体及野生型个体进行鳞片发育情况观察及染色鉴定，发现该突变体基本上没有鳞片发育，而野生型个体鳞片覆盖全身（见图3）。

3、本发明建立的鳞片缺失斑马鱼模式在皮肤附件相关基因功能研究、筛选治疗人类头发稀少等外胚层发育不良药物等方面具有很大的应用价值。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明的斑马鱼EDA基因及Crispr/Cas9靶位点。斑马鱼EDA基因共有8个外显子，通过在线设计筛选了在外显子4位点处的Crispr靶位点。

图2为本发明Crispr/Cas9诱导的斑马鱼EDA基因突变检测。对建立的F1个体提取基因组，利用突变检测引物F-eda和R-eda进行扩增，并对PCR产物进行直接测序，检测是否有突变引入（A和B）；另外对有突变引入的PCR产物进行TA克隆鉴定具体的突变类型（C和D）。其中：

A图为野生型斑马鱼EDA基因包含靶位点区域PCR产物测序结果，框内为靶位点；

B图为PCR产物出现双峰表示有插入或缺失突变的突变型斑马鱼检测结果；

C图为B图检测个体 PCR产物T-A 克隆测序结果，与野生型比较有碱基插入；

D靶位点序列比较，野生型个体靶位点序列（WT）与有15个碱基插入的突变型个体序列(MT +15bp)。

图3为本发明斑马鱼个体茜素红染色。对EDA处理的斑马鱼野生型及突变型个体进行鳞片染色鉴定鳞片发育情况，其中A为突变体斑马鱼，鳞片基本缺失；B为野生型斑马鱼，全身覆盖鳞片。

具体实施方式

实施例1    一种由Crispr/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式，该模式是指包含EDA基因外显子4位点碱基插入的鳞片缺失斑马鱼。

该鳞片缺失斑马鱼模式的建立方法，包括以下步骤：

⑴利用Ensemble在线数据库，查找斑马鱼EDA基因序列no：ENSDARG00000074591并下载，在该序列查找PAM（protospacer-adjacent motif ）序列即5’-GGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG-3’，在EDA基因外显子找到的靶向作用序列为TTAGGCAAGAAAGGGCCCCC【TGG】，并设计并设计突变检测引物F-eda: ttgttttgcttctcatcagttg和突变检测引物R-eda: tttgctctgctgcttcactc。

⑵目标序列的野生型等位基因的测序验证：

随机选取5枚24hpf野生型斑马鱼胚胎，提取基因组DNA模板，然后用F-eda和R-eda进行PCR扩增，得到片段长度为358bp 的PCR扩增产物Ⅰ，该PCR扩增产物Ⅰ以突变检测引物F-eda直接测序，测序效果良好，色谱图可读性好。结果表明目标基因组序列和数据库中的序列一致，无SNP应用重叠。

⑶构建sgRNA：

①载体和插入片段处理：

SgRNA构建载体用Bbsl酶切pT7-gRNA、切胶回收，得到sgRNA克隆骨架pT7-gRNA_BbsIo IE位点作为插入片段，该插入片段做以下处理：用ddH₂O将靶位点的Oligo溶解为10μM，各取5μL等体积混匀，按以下程序进行退火：95 ℃5min，-1℃/30sec/cycle，to 4℃。

②连接体系：

取退火后的靶位点Oligo和sgRNA克隆骨架pT7-gRNA_BbsI各luL跑胶，对插入片段和载体进行定量后，将退火后的靶位点Oligo与gRNA载体连接。因插入片段比较小，最终所定连接体系为：Oligo lμL，pT7-gRNA_BbsI lμL，5×T4 ligase buffer  2μL， T4 ligase  lμL，共 10μL 体系，25℃连接 3~4h。取 5μL，转化到Trans-Tl感受态细胞中。

③菌落PCR验证：

挑取5~10个单克隆到l0μL LB液体培养基中，取lμL用作模板进行PCR扩增，引物为载体通用引物RV-M和靶位点特异突变检测引物R-eda，用EsayTaq DNA Polymerase，l0μL体系进行扩增。目的条带约130bp。挑取阳性克隆送测序，选取序列正确的克隆进行甘油保菌，提取质粒。

⑷建立eda-sgRNA模板：

以PCR法获得sgRNA的体外转录的模板，该模板序列如下： TAATACGACT CACTATAGTT AGGCAAGAAA GGGCCCCCgt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt t。

其中：斜体大写部分为T7启动子部分，下划线部分为gRNA模板，小写字母为sgRNA骨架。

⑸sgRNA体外转录：

以PCR扩增产物Ⅰ为模板，用T7 RNA聚合酶进行sgRNA体外转录，得到sgRNA；sgRNA经无水乙醇法沉淀后使其浓度为1000ng/ul。

其中：体外转录体系是指5×Transcription Buffer  l0μL；l00Mm DTT  5μL；NTP mix (lOmM each)  l0μL；Template (>lμg)  20μL；T7 RNA 聚合酶2μL；RNase Inhibitor (40U)  lμL DEPC 水补足体系到 50μL，37℃反应2h，

取2μL用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测转录效果。

⑹Cas9 mRNA体外转录：

以U7驱动的人源化的Cas9编码序列（Mali et al., 2013. Science, 339(6121):823-6）为模板，用U7 RNA聚合酶进行Cas9体外转录，然后戴帽并加尾，得到Cas9 mRNA；Cas9 mRNA经无水乙醇法沉淀后使其浓度为600ng/ul。

其中：体外转录体系是指5×Tanscription Buffer  l0μL，l00mMDTT  5μL，NTPmix (ATP/CTP/UTP各l0mM，GTP：ImM)： l0μL SP6 RNA Polymerase (SOU)  2μL，Rnase Inhibitor (SOU)  lμL，Template  17μL，CAP (lOmM)  5μL。37℃，水浴1.5h。

取 lμL 进行 1%琼脂糖凝胶检测mRNA合成效果。

①对Cas9 mRNA模板进行消化：加入DNasel 2μL，37℃消化15min。

②酚氯仿抽提及LiCl沉淀：

用DEPC水将Cas9 mRNA体外转录体系补足到100μL，加入酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）100μL，祸旋15s混匀，12000rpm离心30秒，吸取上清至新离心管中，加入氯仿：异戊醇（24：1） 100μL，祸旋15s混勾，12000rpm离心30秒，再次将上清移至新离心管中，加入1/10体积的3 MNaAc (pH4.0)及2倍体积预冷的无水乙醇，上下颠倒，-80℃静置5min。12000rpm离心15min，去除上清，在吸水纸上吸干，加入400μL Ua，颠倒混匀，12000rpm离心15min，吸取上清，加入700μL 70%DEPC乙醇，12000rpm离心15min，小心倒掉上清，再加入700μL 70%DEPC乙醇，再次离心12000rpm15min，去除上清，室温静置3~5分钟彻底挥发乙醇后溶于l0μL Rnase Free水中，取0.5μL用于1%的琼脂糖凝胶电泳检测gRNA浓度。

⑺斑马鱼受精卵的显微注射及突变检测：

将sgRNA与Cas9 mRNA等量混合后，显微注入到1~2细胞期的野生型斑马鱼受精卵，将注射后的斑马鱼胚胎放入28℃恒温箱中培养。一般1μL可以注射300颗卵。

待胚胎发育至24 hpf时，取5枚胚胎，制备基因组DNA模板，然后以突变检测引物F-eda和突变检测引物R-eda进行PCR扩增，得到PCR扩增产物Ⅱ；将所述PCR扩增产物Ⅱ亚克隆到pEASY-T3载体中。并以T7和Sp6通用引物对转化子进行扩增，将PCR产物十个一组共两组直接送测序，测序引物为T7或Sp6其中一条。

TA克隆所用载体为pEASY-T3载体。具体步骤：

在0.2mL的EP管中加入以下反应液第二轮 PCR 产物 2μL，T4 DNA ligase  1μL，10×T4 DNA ligation buffer  1μL，pGM-T vector  1μL，ddH₂O 6μL，16℃连接过夜，第二天转于Trans-Tl感受态细胞中。随机挑取10个白色单菌落用T7和SP6通用引物进行菌落PCR，预期大小片段为350bp，将阳性克隆送天一辉远进行测序。

⑻突变体鳞片发育观察及染色鉴定：

对检测有EDA 基因突变的斑马鱼的鳞片发育情况进行显微观察，筛选获得EDA基因外显子4靶位点引入插入突变导致鳞片缺失突变体，对鳞片发育异常个体进行鳞片染色鉴定，以确定鳞片是否有发育缺陷。

具体步骤如下：用4%福尔马林溶液进行固定24h，70%乙醇脱水5h，然后在1g/L的茜素红溶液中进行染色24h，1%KOH+5%甘油进行脱色48h后，利用 ZESIS Discovery V13显微镜进行成像。

实施例2    该鳞片缺失斑马鱼模式的应用于皮肤附件相关基因功能的验证及外胚层发育不良药物的筛选。

PAM序列

    5’-GGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG-3’

 

靶向作用序列

    TTAGGCAAGAAAGGGCCCCC【TGG】

 

突变检测引物F-eda

     ttgttttgcttctcatcagttg

 

突变检测引物R-eda

     tttgctctgctgcttcactc

 

 

模板序列

TAATACGACT CACTATAGTT AGGCAAGAAA GGGCCCCCgt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt t