羊栖菜多酚分离纯化及对小鼠成纤维细胞抗紫外损伤影响

摘要

羊栖菜多酚属于褐藻多酚，具有抗氧化、化学防御、抑菌、抗肿瘤和抗凝血等广泛生物功能活性，在食品、化妆品以及医疗等行业有很大的应用潜力。紫外线（UV）能通过氧化作用对人皮肤造成紫外损伤，羊栖菜多酚是一种天然的强抗氧化剂，在抗紫外损伤产品方面的应用前景较广阔。本论文首先运用Folin-Ciocalteu比色法对羊栖菜多酚含量进行测定，并对该方法进行了优化；然后利用酶辅助提取法对羊栖菜多酚进行提取，并对提取条件进行了优化；采用大孔吸附树脂法对羊栖菜多酚进行分离纯化，并对纯化条件进行了优化以获得高纯度的羊栖菜多酚，另外测定了其体外抗氧化能力。通过羊栖菜多酚对 UV照射的小鼠成纤维细胞的保护作用、修复作用及细胞内有关抗氧化酶的变化，研究了羊栖菜多酚对小鼠成纤维细胞抗紫外损伤的影响，为羊栖菜多酚在抗紫外损伤方面的应用提供了一定的理论依据和数据支持。 影响羊栖菜多酚含量测定的因素主要有Na2CO3溶液浓度、Folin-Ciocalteu试剂加入量、反应时间、反应温度和最大吸收波长，通过单因素试验得出最优测定条件为：Na2CO3溶液浓度12.5%、Folin-Ciocalteu试剂加入量2mL、反应时间30min、反应温度30℃、最大吸收波长765nm。在最佳测定条件下，对Folin-Ciocalteu比色法测定羊栖菜多酚含量进行了评价，得出该方法的精密度、稳定性、重现性及回收率的相对标准偏差均小于2.0%，表明 Folin-Ciocalteu比色法能较准确地测定羊栖菜样品液中的多酚含量。 影响酶辅助提取羊栖菜多酚的主要因素有复合酶质量比（中性蛋白酶添加量:纤维素酶添加量）、酶解 pH、酶解温度和酶解时间，通过单因素试验对四个影响因素进行了研究，并运用正交试验法优化了提取条件，得出酶解温度和酶解pH对羊栖菜多酚的提取影响较显著；最优提取条件为：复合酶质量比20:1（复合酶量为126mg/g），在酶解pH5.5，酶解温度50℃下酶解45 min。在最优酶解条件下，羊栖菜多酚的提取量能达到9.26 mg/g，较溶剂提取法有明显提高。 羊栖菜多酚的分离纯化先采用溶剂萃取进行初步分离，然后通过树脂吸附得到纯度较高的羊栖菜多酚。通过溶剂萃取得出羊栖菜多酚在乙酸乙酯相中含量最多，为31.24%。通过比较四种大孔吸附树脂对羊栖菜多酚的纯化效果，筛选出AB-8树脂最适合对羊栖菜多酚进行分离纯化。通过单因素试验研究了影响AB-8树脂纯化羊栖菜多酚的因素，如pH、流速、样品液浓度和洗脱剂用量等，得到最佳纯化工艺为：浓度为70μg/mL、pH5的羊栖菜多酚样品液在1.5BV/h流速下进行吸附分离，然后用90mL70%的乙醇溶液在1.5BV/h流速下进行洗脱。在此条件下，羊栖菜多酚含量从溶剂萃取初步分离的31.24%提高至62.15%。然后对纯化后羊栖菜多酚（HFPL）的总还原能力和清除自由基DPPH的能力进行了测定，并与纯化前羊栖菜多酚（HFPB）、维生素C及维生素E作对比，得出四种还原性物质中，HFPL的总还原能力和清除自由基 DPPH的能力明显强于 HFPB，且强于维生素C和维生素E。表明经树脂纯化后，羊栖菜多酚纯度的提高使其体外抗氧化能力得到显著增强。 为了明确羊栖菜多酚对 UV照射的小鼠成纤维细胞抗紫外损伤的影响，研究了UV辐射剂量、羊栖菜多酚浓度及时间对细胞生长的影响，结果表明UV辐射剂量越大，小鼠成纤维细胞受到抑制越严重，UV辐射剂量为0.15J/cm2时最接近半致死剂量，作为后续实验的 UV照射剂量；羊栖菜多酚对小鼠成纤维细胞的保护作用随多酚浓度的增大呈现先增强后减弱的趋势，在羊栖菜多酚浓度为90μg/mL时保护作用最强。从时间上看，加入羊栖菜多酚后培养4h再进行UV照射，保护作用最明显，随着时间的延长，保护作用开始下降。羊栖菜多酚对 UV照射的小鼠成纤维细胞的修复作用，同样随着羊栖菜多酚浓度的增大呈先增强后减弱的趋势，在80μg/mL浓度时修复作用达到最强。此外，羊栖菜多酚能增强UV照射的小鼠成纤维细胞内超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，并降低丙二醛的含量。

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第一章 引 言

1.1 羊栖菜概述

1.1.1 羊栖菜的生长习性

1.1.2 羊栖菜的营养价值

1.1.3 羊栖菜的药用价值

1.1.4 羊栖菜的加工利用

1.2 褐藻多酚概述

1.2.1 褐藻多酚的结构

1.2.2 褐藻多酚的提取方法

1.2.3 褐藻多酚的分离纯化

1.2.4 褐藻多酚的生物活性

1.2.5 褐藻多酚的应用

1.3 紫外线与皮肤紫外损伤概述

1.3.1 紫外线对皮肤的损伤

1.3.2 抗紫外损伤产品研发现状

1.4 研究目的与意义

第二章 羊栖菜多酚的提取及条件优化

2.1 羊栖菜多酚含量测定方法的条件优化

2.1.1 试验材料

2.1.2 试验方法

2.1.3 结果与分析

2.2酶辅助提取羊栖菜多酚工艺条件优化

2.2.1 试验材料

2.2.2 试验方法

2.2.3 结果与分析

2.3本章小结

第三章 羊栖菜多酚的分离纯化及体外抗氧化能力测定

3.1 大孔吸附树脂法分离纯化羊栖菜多酚及工艺条件优化

3.1.1 试验材料

3.1.2 试验方法

3.1.3 结果与分析

3.2 羊栖菜多酚体外抗氧化能力测定

3.2.1 试验材料

3.2.2 试验方法

3.2.3 结果与分析

3.3 本章小结

第四章 羊栖菜多酚对小鼠成纤维细胞抗紫外损伤的影响

4.1羊栖菜多酚对UV照射的小鼠成纤维细胞的保护作用

4.1.1 试验材料

4.1.2 试验方法

4.1.3 结果与分析

4.2 羊栖菜多酚对UV照射的小鼠成纤维细胞的修复作用

4.2.1 试验材料

4.2.2 试验方法

4.2.3 结果与分析

4.3 羊栖菜多酚对UV照射的小鼠成纤维细胞与抗氧化相关的酶的变化

4.3.1 试验材料

4.3.2 试验方法

4.3.3 结果与分析

4.4 本章小结

第五章 结论与展望

参考文献

致谢