瘤背石磺内参基因筛选和皮肤发育相关基因EGF和IF的克隆与表达分析

摘要

瘤背石磺（Onchidium struma）是生活于滩涂湿地的半咸水两栖性生物，隶属于软体动物门（Mollusca）、腹足纲（Gastropoda）、肺螺亚纲（Pulmonata）、缩眼目（Systellommatophora）、石磺科（Onchidiidae），是一种具有很高的食用和药用价值的贝类。其生活区域常见于中国的江苏省、上海市、浙江省、福建省、广东省等地的淡水与海水交汇处的高潮带，其温度适应能力强、分布范围广、野生资源量非常丰富。目前国内外学者对于石磺的研究工作主要集中在系统分类学、生物学形态特征、营养价值评定、胚胎发育和繁殖机制以及活性物质的分离提取等方面。
　　表皮生长因子可促进上皮细胞的增殖发育，中间丝蛋白在维持细胞形态上发挥重要作用，内参基因的筛选是进行基因定量分析的前提条件。石磺科的蜕皮现象涉及到上皮细胞的大量更新，其运动能力则与肌肉细胞的形变程度有联系。本文对瘤背石磺进行了内参基因的初步筛选，初步探讨功能基因EGF和IF的理化结构和进化关系，并针对两基因在石磺蜕皮与否和运动能力强弱上进行了较为深入的分析，希望能为研究瘤背石磺生物学类两栖特性相关的功能基因积累资料。
　　1．依托瘤背石磺转录组分析数据库，挑选出7个常用内参基因的序列作为候选基因，经NCBI上BLAST比对及初步鉴定后，设计荧光定量PCR引物，统计分析各候选基因在瘤背石磺不同组织中表达的稳定性。BestKeeper软件分析显示其稳定性大小为：EF1α＞TUBB＞RPL28＞Ubiq＞18SrRNA=CYC＞ACTB；在geNorm软件的分析结果里，稳定性的大小为：EF1α＞RPL28＞CYC＞Ubiq＞TUBB＞18S rRNA＞ACTB；而Normfinder软件给出的稳定值排序为：EF1α＞RPL28＞Ubiq＞CYC＞TUBB＞18SRNA＞ACTB。常用内参基因的ACTB的标准差（SD）最大，其表达稳定性在7个候选基因中最低，稳定性最高的候选基因为EF1α。在瘤背石磺的不同组织表达分析时筛选出最适合内参基因为EF1α，而由Normfinder软件给出的最优内参基因组合为EF1α和RPL28。
　　2．从瘤背石磺背部皮肤组织中克隆得到了瘤背石磺表皮生长因子（Os-egf1）基因，并进行序列分析、结构预测和组织表达水平测定。利用RACE克隆技术所获得的Os-egf1基因的cDNA序列全长为1158bp，其开放阅读框（ORF）长度为846bp，并编码一条长为281个氨基酸残基的多肽链；没有明显的信号肽，分子量为30.51kDa，该基因存在一个跨膜结构域（膜内1-16aa,膜上17-39aa，膜外40-281aa），亚细胞定位发现该多肽位于细胞核内，理论等电点（PI）是5.41，为一个偏酸性的蛋白。有6个Ser、3个Thr、3个Tyr可能为蛋白激酶磷酸化作用的位点。Os-egf1氨基酸的序列中半胱氨酸（Cys）残基明显较多，占氨基酸残基总数的11.40％，并不分布于多肽链的N端和C端，多集中于肽链的中段部分。半胱氨酸残基主要分布在对应的三个EGF-like的结构域里，且结构域中至少6个半胱氨酸残基参与形成CX7 CX4-5 CX10-13 CXCX8 C的类似结构，推测其相互之间形成的3对二硫键为维持结构域特定的空间结构所必需。除去结构域中的半胱氨酸残基，该基因的序列保守性非常低，进化树结果显示EGF家族中不同成员各自聚为一支。瘤背石磺不同组织的相对定量分析显示 Os-egf1高表达于背部皮肤，表皮生长因子可促进上皮细胞的增殖分裂，初步推测Os-egf1基因与瘤背石磺蜕皮现象明显与否有关。
　　3．从瘤背石磺背部皮肤组织中克隆了瘤背石磺中间丝蛋白（Os-IF1）基因，序列拼接结果显示，所克隆得到的Os-IF1基因的cDNA核酸序列全长为1957bp，其开放阅读框长度为1359bp，并编码一条长为452个氨基酸残基的多肽链。没有明显的信号肽，分子量为51.54kDa，不存在跨膜结构域，亚细胞定位发现该多肽位于细胞核内，理论等电点为5.21，为一个偏酸性的蛋白，含有23个Ser、14个Thr、6个Tyr蛋白激酶磷酸化位点。Os-IF1预测的氨基酸序列中，以α螺旋为主，占据整条多肽链的82%，符合中间丝蛋白的典型特征。氨基酸序列的同源性比对发现其与中间丝蛋白家族成员的序列同源性较高。在相对定量表达分析中，Os-IF1在瘤背石磺中表达量较高的为前触角和腹足两个组织，而其他三种石磺表达量最高的组织均为腹足，推测该基因产物与石磺运动过程中腹足肌肉的收缩有关。不同种石磺之间的表达分析显示，瘤背石磺中的表达量最高，具体原因有待于进一步的探究。序列比对中发现该基因的保守性非常高，而进化树基本表现为：腹足纲、头足纲、双壳纲、脊索动物和脊椎生物各自聚在一起形成分支，与瘤背石磺进化关系最近的是光滑双脐螺。

目录

声明

引言

第1章 内参基因、表皮生长因子以及中间丝蛋白的研究意义和进展

1.1内参基因概述

1.2 表皮生长因子（EGF）的研究进展

1.3中间丝蛋白（Intermediate Filament，IF）的研究概述

第2章 瘤背石磺的内参基因初步筛选

2.1 材料和方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

第3章 瘤背石磺中表皮生长因子（EGF）的克隆、分析

3.1 材料和方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

第4章 中间丝蛋白（Os-IF1）基因的克隆及其在四种石磺物种间的表达分析

4.1 材料和方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

小结

参考文献

附录

致谢