尼罗罗非鱼Ddx41介导的信号通路相关基因的克隆及功能分析

摘要

罗非鱼是我国水产养殖的优势品种，具有重要的经济价值，但近年来高死亡率链球菌病频发，严重威胁到罗非鱼养殖产业的健康发展，且尚未发现有效的防治措施，因此深入探索罗非鱼抗病的分子机理十分必要。先天免疫是鱼类免疫防御的第一道防线，模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)是先天免疫受体的代表，可以与病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)相互作用，是启动先天免疫应答的关键因子。Ddx41(D-E-A-D(aspartate-glutamate-alanine-aspartate-box)polypeptide41)是由ddx41基因编码的RNA解旋酶，能够作为PRR识别宿主细胞内细菌和病毒所产生的PAMPs，激活干扰素基因刺激分子(stimulator of interferon genes,sting)依赖的天然免疫应答过程。完善的先天免疫系统的形成需要多种调控机制，近期三重基序(tripartite motif,TRIM)蛋白家族被发现能够作用于细胞内先天免疫信号通路相关因子并影响先天免疫反应。本研究拟从尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)可感知胞质DNA的ddx41基因入手，同时对Ddx41的推测胞内接头蛋白Sting及推测调控因子Trim16和Trim25的编码基因进行基因结构分析及表达特征检测，初步了解上述基因的生物学功能。在此基础上构建真核表达载体，研究哺乳动物293T细胞中过表达上述基因对NF-κB(Nuclear factor-κB)活性的影响。以期为揭示罗非鱼的免疫抗感染机制、探索病害防治新途径，保证罗非鱼养殖业的持续健康发展提供基础资料。
　　1.尼罗罗非鱼ddx41和sting基因的克隆及表达分析
　　为了研究ddx41和sting基因在尼罗罗非鱼免疫过程中的作用，本研究通过逆转录PCR(RT-PCR)和末端快速扩增(RACE)获得尼罗罗非鱼ddx41和sting基因的cDNA及基因组序列，进行了基因结构和蛋白二级结构分析，并以 qRT-PCR方法检测基因的组织分布、胚胎发育过程表达及其对无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)感染的响应。结果表明，尼罗罗非鱼ddx41基因的cDNA序列全长2230 bp，ORF1842 bp，编码614个氨基酸，基因组序列全长为8138 bp，包含17个外显子和16个内含子。蛋白二级结构分析显示，Ddx41存在Coliedcoil结构域，DEXDc结构域，HELICc结构域以及 ZnF-C2HC结构域。氨基酸序列同源性分析表明，尼罗罗非鱼Ddx41与斑马拟丽鱼(Maylandiazebra)、伯氏朴丽鱼(Haplochromis burtoni)、三湖慈鲷(Pundamilia nyererei)以及布氏新亮丽鲷(Neolamprologus brichardi)同源性大于99.0％，与其他鱼类以及哺乳动物同源性在85.6%~97.6%之间。组织表达分析表明，在所检测的11个组织/器官中ddx41基因均有表达，其中血液中表达量最高，肝脏中表达量最低，血液中的表达量为肝脏(对照组)表达量的27.51倍。ddx41基因在尼罗罗非鱼胚胎发育过程中均有稳定表达且表达水平有逐渐升高的趋势。人工感染无乳链球菌后ddx41基因在肠、脾脏、鳃、肾脏中表达量存在升高的阶段，分别为0 h(对照组)的4.05、5.74、4.12、2.27倍，在血液中该基因的表达量呈现降低趋势。sting基因的cDNA全长2724 bp，ORF1209 bp，编码403个氨基酸，基因组序列全长10746 bp，包含6个外显子和5个内含子。氨基酸序列同源性分析表明，尼罗罗非鱼Sting与斑马拟丽鱼同源性最高为95.2%，与其他鱼类以及哺乳动物同源性介于28.5%~94.9%之间。组织表达分析表明，在所检测的11个组织/器官中，sting基因均有表达，其中肠中表达量最高，心脏中表达量最低。sting基因在尼罗罗非鱼胚胎发育过程中均有表达且表达量呈现升高的趋势。人工感染无乳链球菌后，sting基因在所检测的5个组织/器官中的表达量均存在升高的阶段，sting基因在肠、脾、鳃、肾脏和血液中的最高表达量分别为对照组的4.99、15.19、15.74、5.81和6.33倍。上述结果表明：ddx41基因和 sting基因在尼罗罗非鱼抗无乳链球菌感染过程中发挥了重要作用。
　　2.尼罗罗非鱼trim16和trim25基因的克隆及表达分析
　　为了研究trim16和trim25基因在尼罗罗非鱼免疫过程中的作用，本研究以RT-PCR和RACE方法获得尼罗罗非鱼trim16和trim25基因的cDNA及基因组序列，并进行了基因结构和蛋白二级结构分析，qRT-PCR检测基因的组织分布、胚胎发育过程表达及其对无乳链球菌感染的响应。结果表明，trim16基因的cDNA全长2314 bp，ORF1674 bp，编码558个氨基酸；trim25基因的cDNA全长2748 bp，ORF1674 bp，编码558个氨基酸，二者基因组序列均无内含子。蛋白二级结构分析显示，Trim16和Trim25均具有TRIM家族的RING finger结构域、B-Box结构域等保守结构。氨基酸序列同源性分析表明，尼罗罗非鱼Trim16与其他硬骨鱼类和哺乳动物同源性介于29.0%~92.6%之间，Trim25与其他硬骨鱼类和哺乳动物同源性介于20.0%~88.1%之间，二者均与斑马拟丽鱼同源性最高(分别为92.6%和88.1%)。组织表达分析表明，在所检测的11个组织/器官中，trim16和trim25基因均有表达，其中血液中表达量最高，肝脏中表达量最低，血液中的表达量分别为肝脏(对照组)的60.46和274.07倍。trim16和trim25基因在尼罗罗非鱼胚胎发育过程中均有表达。人工感染无乳链球菌后，trim16和trim25基因在所检测的5个组织/器官的表达量均存在明显升高阶段，trim16基因在肠、脾、鳃、肾脏和血液中的最高表达量分别为0 h(对照组)的1.30、2.09、1.61、7.81和6.10倍；trim25基因在肠、脾、鳃、肾脏和血液中的最高表达量分别为对照组的11.13、1.22、1.26、61.41和77.80倍。上述结果表明：trim16和trim25基因在尼罗罗非鱼抗无乳链球菌感染的过程中发挥了重要作用。
　　3.过表达ddx41、sting、trim16和trim25基因对293T细胞中NF-κB活性的影响
　　为进一步研究ddx41、sting、trim16和trim25基因的功能及其相互作用，在本章中构建了上述基因的真核表达载体，瞬时转染293T细胞，研究基因的过表达对NF-κB活性的影响。实验结果表明，ddx41、sting、trim16和trim25基因真核表达载体可以在293T细胞中稳定表达并增强NF-κB活性。推测上述基因通过对NF-κB活性的调控在尼罗罗非鱼抗无乳链球菌感染的过程中发挥了重要作用。

目录

声明

引言

1罗非鱼养殖现状和主要病害概述

2 RNA解旋酶Ddx41的研究进展

3 Sting蛋白的研究进展

4 TRIM家族的研究进展

5 本研究的目的和意义

第一章 尼罗罗非鱼ddx41和sting基因的克隆及表达分析

1材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 结论

第二章 尼罗罗非鱼trim16和trim25基因的克隆及表达分析

1材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 结论

第三章 哺乳动物细胞系中过表达尼罗罗非鱼ddx41、sting、trim16和trim25基因对NF-κB活性的影响

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

4结论

全文总结

1 尼罗罗非鱼ddx41和sting基因cDNA克隆及表达分析

2 尼罗罗非鱼trim16和trim25基因cDNA克隆及表达分析

3 过表达尼罗罗非鱼ddx41、sting、trim16和trim25基因基因对哺乳动物293T细胞中NF-κB活性的影响

参考文献

附录

致谢