碱性蛋白酶抑制剂LupI-MSSS的原核表达、纯化及晶体条件初筛

摘要

沙雷氏蛋白酶基因在产生该酶基因的菌株基因组中都有一个抑制该蛋白酶活性的基因位于其上游或者下游。低温碱性金属蛋白酶MP是从菌株YS-80-122中提取纯化的，属于沙雷氏蛋白酶家族，与该家族报道的其他酶的结构类似，氨基酸同源性最高为83％。在MP基因下游有一抑制剂基因lupI，与现有假单胞杆菌蛋白酶抑制剂APRin的氨基酸同源性为55%，该抑制剂可以完全抑制蛋白酶MP的活性。为进一步探究N端序列延伸后对抑制剂活性的影响，在野生型抑制剂基因的基础上，通过定点突变将LupI的N端增加Met-Ser-Ser-Ser，本实验对抑制剂基因lupI-MSSS在大肠杆菌中进行了表达；并通过单因素法和响应面法相结合对该抑制剂的发酵表达条件进行了优化；同时对表达后的蛋白进行了纯化以满足后续结晶的纯度要求；最后对抑制剂LupI-MSSS的结晶条件进行了初筛，研究结果分述如下：
　　抑制剂LupI-MSSS在大肠杆菌中的表达：利用定点突变试剂盒设计合成两端引物，以 LupI野生型表达质粒 pET28-lupI为模板，进行 PCR扩增，构建pET28a-lupI-MSSS原核表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)进行培养。挑选阳性单克隆进行双酶切验证，酶切后表达片段约为363 bp，与预期一致。将表达正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，扩大培养，并进行诱导表达。菌液重悬破碎后留上清，SDS-PAGE凝胶电泳结果表明该蛋白的大小约11 KDa，与预测的蛋白分子质量相同，同时活性测定也表明表达的该抑制剂可以完全抑制碱性蛋白酶MP的活性。
　　抑制剂LupI-MSSS在大肠杆菌中表达条件优化：采用单因素试验对重组大肠杆菌表达抑制剂LupI-MSSS的培养诱导条件（初始培养基pH、接种量、诱导剂添加时间、诱导剂终浓度、诱导时间、诱导温度、摇床转速）进行了优化，并针对以上七个因素，利用Plackett-Burman试验筛选出3个主要影响因子：诱导剂添加时间、诱导剂终浓度、诱导时间。利用响应面试验对以上三个主要因素进行了优化，最终确定的发酵表达条件为：初始培养基pH为7，接种量2%，诱导剂添加时间2 h，诱导剂IPTG终浓度0.5 mmol/L，诱导温度为37℃，诱导时间为8.5 h，摇床转速为200 r/min。
　　抑制剂LupI-MSSS的纯化：发酵制备抑制剂粗蛋白液，经过三步纯化：超滤、Superdex200凝胶过滤层析和Q-Sepharose离子交换层析。最终纯化得到的样品纯化倍数为20，回收率为60.7%，SDS-PAGE电泳结果显示为单一的目的条带。通过HPLC法对蛋白样品的纯度进行鉴定，其纯度高达99.7%，达到预期要求，可供后续结晶试验使用。
　　抑制剂LupI-MSSS结晶条件初筛：利用Hampton Research的试剂盒对抑制剂LupI-MSSS的晶体生长条件进行了初筛。HR2-144 Index试剂盒，20℃培养发现其中22个条件下都有晶体生长，且晶型较一致。挑取状态较好的单晶进行SDS-PAGE电泳检测，发现有目的条带存在，说明显微镜下观察到的晶体确实为抑制剂蛋白结晶。

目录

声明

引言

第一章 文献综述

1.1蛋白酶

1.2沙雷氏蛋白酶

1.3蛋白纯化方法

1.4蛋白质晶体学

1.5本实验的立题依据及主要研究内容

第二章 pET28a-lupI-MSSS原核表达载体的构建

2.1材料与仪器

2.2实验方法

2.3试验结果

2.4本章小结

第三章 LupI-MSSS在大肠杆菌中的表达及表达条件优化

3.1材料与方法

3.2分析方法

3.3结果与讨论

3.4本章小结

第四章 抑制剂lupI的纯化

4.1材料与仪器

4.2试验方法

4.3试验结果

4.4 本章小结

第五章 LupI-MSSS的结晶条件初筛

5.1材料与仪器

5.2试验方法

5.3结果与讨论

5.4本章小结

结论与展望

参考文献

致谢