饲料中真菌毒素分析方法及在体内代谢转化的研究

摘要

真菌毒素是真菌在适宜的环境条件下产生的次级有毒代谢产物，具有致癌、致畸及致突变等毒性作用。真菌毒素的摄入还可造成毒素及其代谢产物在畜禽体内残留，进而通过肉、奶等动物源性产品进入人食物链中，给消费者造成安全风险。目前，已经发现的具有毒性的真菌毒素有30余种，其中广受关注的真菌毒素主要为有黄曲霉毒素（AFB1）、赭曲霉毒素A（OTA）和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）等。许多国家针对不同产品已制定真菌毒素的限量标准。近年来，奶牛饲料和鲜奶中真菌毒素的污染受到广泛关注。
　　本论文首先对饲料中常见的30种真菌毒素进行检测技术研究，进而针对目前污染较为严重但是容易被忽略的隐蔽型真菌毒素，建立灵敏、快捷、可靠的检测技术。采用建立的检测技术，对不同的饲料样本进行筛查，探明饲料中真菌毒素的暴露水平和暴露种类。然后，对典型真菌毒素 AFB1和 OTA进入奶牛体内后的代谢动力学情况进行研究，揭示典型真菌毒素的吸收、分布、代谢和排泄规律，对今后保障鲜奶安全、制定饲料中限量标准具有重要意义。本文主要研究内容和结论如下：
　　（1）采用QuEChERS（Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe）前处理技术结合超高效液相色谱-串联质谱检测不同饲料样品（预混料、浓缩料和配合料）中30种真菌毒素的含量。饲料样品经过5 mL水和5 mL1％甲酸乙腈溶液提取后取上清液氮吹至近干后，残渣经1 mL5 mmol/L醋酸铵水溶液/乙腈溶液（80/20, v/v）复溶上机测定，采用基质加标结合同位素内标法进行定量分析。本方法在不同的线性范围内均线性良好，相关系数 R2≥0.99，检出限（ limit of detection, LOD）在0.7~20μg/L之间，定量限（limitofquantitation,LOQ）在2~50μg/L之间。低、中、高浓度添加水平下30种真菌毒素平均回收率为72.0%~118.4%。该方法具有简单、快速、实用性强等优点，能适用于预混料、浓缩料和配合料中30种真菌毒素的定量分析。将建立的分析方法应用到38个饲料样品中39种真菌毒素的测定，其中，31份饲料样品被 DON污染，污染率最高，含量为59.3~576.8μg/kg；有21份饲料样品被15-ADON污染，含量为62.3~984.3μg/kg；有7份饲料样品被D3G污染，含量为27.8~127.1μg/kg；另外，在不同的饲料中还发现了伏马毒素 B1（FB1）、伏马毒素 B2（FB2）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、β-玉米赤霉烯酮（β-ZOL）、展青霉素（PAT）和AFB1等真菌毒素。
　　（2）通过优化提取溶剂，HLB小柱的上样液，淋洗和洗脱溶剂等，首次建立了一种用于 DON，3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-ADON）、15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-ADON）、镰刀菌烯酮（FUS-X）和3-葡萄苷化脱氧雪腐镰刀菌烯醇（D3G）富集、净化的前处理方法。净化样品液通过超高效液相色谱串联质谱分析。建立的分析方法通过方法学包括线性（R2≥0.99）、灵敏度（LOQ范围为0.08~4.85μg/L）、回收率（79.3%~108.1%）验证后表明，该分析方法快速、灵敏、准确。进而将建立的分析方法应用于31个饲料样品中的4种B型单端孢霉烯族类毒素和D3G的测定。其中，26个样品被不同真菌毒素污染，含量范围为2.1~864.5μg/kg，而D3G也在17个样本检测到，其浓度范围在2.1~34.8μg/kg。
　　（3）建立了鲜奶、尿液、血浆、心、肝、脾、肺和肾中AFB1、AFM1、OTA和赭曲霉毒素α（OTα）四种真菌毒素的分析方法，样品经1400μL丙酮提取后取上清液氮气吹干，200μL5 mmol/L醋酸铵水溶液/乙腈溶液（80/20, v/v）复溶上机测定。方法学结果表明四种真菌毒素在定量限、低、中和高添加水平下，回收率范围为为82.8%~114.1%。在0.1~200μg/L范围内线性关系良好（R20.990）， LOD值在0.03~0.2μg/L之间，LOQ值在0.1~0.5μg/L之间。血浆和组织器官内4种真菌毒素的短期（8 h）、长期（20 d）和冷冻解冻三循环稳定性范围为80.9%~113.6%。证明建立的分析方法具有简单、快速、实用性强等优点，能适用于奶、尿、血、心、肝、脾、肺和肾中四种真菌毒素的定量分析。
　　（4）将天然培养的富含 AFB1或 OTA的基体标准物质与饲料样本混合后，获得一定含量真菌毒素的奶牛饲料（AFB1的含量为1000μg/kg，OTA的含量为750μg/kg），饲喂奶牛，在10、35、45、60、120、180、240、360、540、720、1440、2160、2880 min处分别取血，在6h屠宰奶牛取心、肝、脾、肺、肾、脑器官。采用（3）建立的分析方法对不同组织器官中真菌毒素及其典型代谢产物进行分析后。结果表明：AFB1在体内吸收速度较快，10 min血液中就可检测到AFB1，在35 min处达到峰值，48h检测不到。AFB1向乳中的转化率为1.1%~1.6%，鲜奶中的AFM1清除期为2天。在心、脾、肺和肾检测到AFB1毒素（含量分别为1.6、4.1、3.3和5.6μg/kg），在脾和肾中检测到AFM1毒素（含量分别为0.7和0.8μg/kg）。OTA在奶牛中基本难以吸收，鲜奶、血液及各组织器官中均未检测到OTA和OTα。但是在尿液中检测到少量OTA和大量代谢物OTα毒素，最大值分别为1.8μg/L和324.6μg/L，表明OTA在体内不吸收，在体内代谢转化成OTα后排出体外。

目录

声明

第一章 引 言

1.1真菌毒素概述

1.2真菌毒素分析方法的研究进展

1.3真菌毒素的体内代谢研究进展

1.4 本文主要研究内容及意义

第二章不同饲料中30种真菌毒素分析方法的建立

2.1仪器、试剂与材料

2.2实验方法

2.3 结果与讨论

2.4实际样品分析

2.5 本章小结

第三章不同饲料中4种B型单端孢霉烯族类毒素和隐蔽性DON毒素分析方法的建立

3.1 仪器、试剂与材料

3.2 实验方法

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

第四章 鲜奶、尿液、血浆和不同组织器官中四种真菌毒素分析方法的建立

4.1 材料与方法

4.2实验方法

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

第五章 奶牛体内黄曲霉毒素和赭曲霉毒素代谢转化规律的研究

5.1 材料与方法

5.2实验方法

5.3 结果与讨论

5.4 本章小结

总结

参考文献

作者在攻读硕士学位期间发表的学术论文及成果

致谢