基于长片段PCR扩增的贝类疱疹病毒全基因组高通量测序及变异分析

摘要

20世纪70年代美国首次出现疱疹病毒感染软体动物（一批养殖试验用美洲牡蛎）的案例，但并未对当地和全球其他地区牡蛎和贝类养殖业造成损害。然而进入90年代后，疱疹病毒感染引起的牡蛎、扇贝、蛤类和鲍等贝类的死亡案例在全球范围内（主要包括欧洲、美国、澳洲以及我国）频繁发生，给当地贝类养殖业造成巨大经济损失。经形态学电镜观察、病毒分离纯化和全基因组测序比对后，两种新疱疹病毒：牡蛎疱疹病毒（Ostreid herpesvirus1，OsHV-1）和鲍疱疹病毒（Haliotid herpesvirus1，HaHV-1）被相继鉴定出来。OsHV-1和HaHV-1同隶属于软体动物疱疹病毒科（Malacoherpesviridae），是该病毒科下唯一已知的两个病毒种。OsHV-1属于牡蛎疱疹病毒属（Ostreavirus），可感染多种双壳贝类；HaHV-1属于鲍疱疹病毒属（Aurivirus），感染单壳贝类。
　　随时间的发展，OsHV-1也发生了较强的株系分化。但受制于技术所限，对不同年代变异株基因组序列信息的掌握甚少。本研究尝试利用基于长片段PCR方法的贝类疱疹病毒基因组富集技术，对低温冻存的多年份栉孔扇贝及魁蚶感染OsHV-1和九孔鲍感染HaHV-1的基因组进行富集，使用高通量测序技术获取OsHV-1不同变异株序列信息，并分析了不同变异株与其他变异株的基因组变异和系统发育关系。研究方法及部分结果如下：
　　第一部分：建立一套对于长期低温冻存贝类病料样本中牡蛎疱疹病毒的基因组富集方法，通过病毒悬液法提取病毒基因组DNA，根据参考基因组（207,439 bp）设计23对引物，使用Takara高保真聚合酶GXL扩增了2001年份冻存的栉孔扇贝牡蛎疱疹病毒全基因组，并使用Illumina Hiseq PE2500高通量测序平台进行第二代测序；同时使用PacBio RS II系统进行第三代高通量测序（SMRT）。第二代测序共获得8个Scaffolds，分别为170,095、18,675、1929、1805、1395、834、825和600 bp。第三代测序获得117,873个clean subreads，平均长度7202 bp。组装后对于基因组末端序列以及有问题的区域通过Sanger测序以及二代测序作进一步验证。修补后获得长204,783 bp的全基因组序列。基于11个OsHV-1变异株的32个ORF基础上进行的系统发育关系分析显示，2001年份分离的OsHV-1变异株与2009年分离自我国栉孔扇贝的AVNV亲缘关系最近，而与2008年以后出现的OsHV-1μvar及其相关变异株的亲缘关系最远。OsHV-1变异株间的亲缘关系受到宿主及时空分布范围的影响。研究表明，本试验建立的OsHV-1基因组富集方法易用且有效。
　　第二部分：利用新建立的从冻存贝类病料中扩增牡蛎疱疹病毒基因组的富集方法，成功扩增了多年份栉孔扇贝病料（2002年、2003年、2004年、2008年）及2015年魁蚶病料中OsHV-1的基因组。构建小片段文库，通过Illumina Hiseq PE2500平台进行高通量测序并进行变异序列分析。多年份病毒株第二代测序分别获得长度为180,686 bp、182,857 bp、190,414 bp、173,253 bp和192,676 bp的基因组。测序序列GC含量分别为38.6％（ZK2002）、38.8%（ZK2003）、38.9%（ZK2004）、38.8%（ZK2008）、38.5%（KH2015）。系统发育关系分析显示多年份栉孔扇贝OsHV-1变异株与AVNV亲缘关系最近，而与2008年以后出现的OsHV-1μvar及其相关变异株的亲缘关系最远。2015年OsHV-1魁蚶株与2012年分离自我国魁蚶的Os HV-1-SB亲缘关系最近。本研究建立的基因组富集方法可以适用于OsHV-1不同变异株基因组的富集，并进行后续的变异序列分析。
　　第三部分：参照新建立的从冻存贝类病料中扩增牡蛎疱疹病毒基因组的富集方法，建立起扩增鲍疱疹病毒基因组富集方法。通过病毒悬液法提取病毒基因组DNA，根据参考基因组设计引物，使用Takara高保真聚合酶GXL扩增了2016年份鲍疱疹病毒基因组，琼脂糖凝胶电泳显示，成功获得21个长9~13 kbp的目的条带。本研究建立的基因组富集方法可以适用于HaHV-1变异株基因组的富集，并进行后续的变异序列分析。

目录

声明

引言

1.疱疹病毒研究进展

2. 牡蛎疱疹病毒（OsHV-1）

3. 鲍疱疹病毒（HaHV-1）

4. PCR及测序技术的发展

5. 贝类疱疹病毒测序现状

6. 研究意义

第一章：牡蛎疱疹病毒全基因组扩增方法的建立及高通量测序

1.实验材料

2.实验方法

3. 结果

4. 讨论

第二章：基于长片段PCR的多年份牡蛎疱疹病毒基因组扩增及高通量测序

1.实验材料

2.实验方法

3.结果

4.讨论

第三章：基于长片段PCR的鲍疱疹病毒基因组扩增

1.实验材料

2.实验方法

3.结果

4.讨论

全文小结

参考文献

致谢