中药桑寄生抗肿瘤蛋白的分离纯化及部分性质研究

摘要

本文探索了中药桑寄生蛋白的提取方法，考查了温度、时间，三种过滤方法(纱布过滤、0.2μmm滤膜过滤和滤纸抽滤)对分离提取的影响，并通过硫酸铵饱和度和pH值等盐析条件的试验研究和离心条件的选择，初步得出较合理的粗提流程： 干燥的中药桑寄生粉碎机打成约200目细粉→加入0.15mol/l的NaCl溶液浸泡12h→过滤得到滤液→加入固体硫酸铵，使溶液达到45％的饱和度，4℃静置4h→4℃，离心(6000rpm,20min)→取得沉淀，加入少量的蒸馏水溶解→转移至透析带，对蒸馏水透析至盐被去除→随透析带放入甘油浓缩3h→得桑寄生蛋白粗品。 进一步对桑寄生蛋白粗品进行分离纯化。主要是采用层析方法：首先用SephadexG100分子筛分离粗品蛋白，得到大分子量组分a和小分子量组分b；用CM-SepharoseFastFlow分离桑寄生的大分子物质，得到四个组分：组分Ⅰ，组分Ⅱ，组分Ⅲ和组分Ⅳ。为确定上述获得的组分蛋白的分子量本文采用SDS-PAGE电泳，具体摸索了SDS-PAGE电泳条件：：包括上样量、浓缩胶和分离胶的浓度、电泳所用电压、染色时间等。研究选用肝癌细胞Bel-7402，经MTT染色法检测了其抗肿瘤活性。初步得出实验结果：在我国中药桑寄生中分离到的组分Ⅱ(包含两种蛋白或亚基)，分子量在31，000和33，000左右，具有抑制肝肿瘤细胞Bel-7402生长作用,IC50为6mg/l，组分Ⅲ中分子量在21，000左右的蛋白抗肝肿瘤细胞Bel-7402作用不明显；组分Ⅳ中分子量小于14，000的蛋白没有抗肿瘤作用，分子量为36，000的蛋白的抗肿瘤作用有待进一步试验确定。

目录

文摘

英文文摘

原创性声明及本论文使用授权说明

1.绪论

1.1肿瘤

1.1.1肿瘤的产生及危害

1.1.2治疗肿瘤的新方法

1.2植物药治疗肿瘤的概况

1.2.1长春花植物药

1.2.2喜树植物药

1.2.3三尖杉植物药

1.2.4鬼臼植物药

1.2.5紫杉植物药

1.3桑寄生

1.3.1桑寄生的概况

1.3.1国外用桑寄生治疗肿瘤的概况

1.3.2国内对桑寄生的研究概况

1.4立题依据及目的、意义

1.5论文的主要研究内容

2.实验材料和方法

2.1材料与试剂

2.1.1实验材料

2.1.2试剂

2.1.3实验仪器及设备

2.2实验方法

2.2.1蛋白含量测定方法

2.2.2糖含量的测定方法

2.2.3 SDS-PAGE电泳

2.2.4桑寄生蛋白粗品的提取

2.2.5桑寄生蛋白的纯化

2.2.6 MTT法

3.结果和分析

3.1凯氏定氮测定蛋白含量结果

3.2 Bradford法测定蛋白含量结果

3.3糖含量的测定结果

3.4粗品的提取结果

3.4.1浸提条件

3.4.2过滤方法的研究

3.4.3盐析条件

3.4.4离心条件

3.5分离纯化

3.5.1分子筛分离情况

3.5.2 CM-Sepharose Fast Flow柱分离情况

3.6 MTT实验结果

4.实验讨论

5.全文结论与展望

5.1全文结论

5.2展望

附录1：u*6（6 4）均匀设计表

参考文献

作者在攻读硕士学位期间公开发表的论文

致谢