白灵菇溶血蛋白（Pleurotus nebrodensis hemolysin）的分离纯化及抗肿瘤抗病毒性质研究

摘要

本文对白灵菇溶血蛋白的研究主要包括目标蛋白的纯化，基本理化性质以及抑制肿瘤生长、抗病毒活性等几个方面。白灵菇经捣碎、生理盐水浸取、CM-Sepharose阳离子交换层析、DEAE-Sepharose阴离子交换及Sephacryl S-200分子筛层析可纯化得到白灵菇溶血蛋白纯品，经SDS-PAGE检测为单一蛋白染色带。Sephacryl S-200分子筛凝胶过滤测得TDA的表观分子量为27KD，SDS-PAGE显示其亚基分子量约为27 KD，证明Nebrodeolysin分子为由单个亚基组成的蛋白。等电聚焦结果显示，TDA的等电点大约为6.1。 白灵菇溶血蛋白具有很强的兔血细胞溶血活性，在25°C三十分钟内0.1 μg/ml浓度的样品可以引起50％的兔血细胞溶解，在加入浓度为0.3μg/ml溶血蛋白到兔血细胞3分钟后大约90％的胞内钾离子外渗。同样的，对于人A、B、AB、O型血细胞，白灵菇溶血蛋白也具有溶血的性质。糖抑制实验结果显示单糖，寡糖对溶血蛋白的抑制作用均不明显，表明白灵菇溶血蛋白不能特异性的结合糖类，这与其他参考文献上面的描述是一致的，说明该类蛋白在作用过程当中并非与细胞膜上的糖相互作用，而是与细胞膜上的脂类物质作用，在细胞膜上形成膜孔复合物引起血细胞溶解。 在抑菌生长方面，白灵菇溶血蛋白对仅玉米絮胞菌有微弱的抑制活性，对曲霉、枯草杆菌、小麦枯萎菌、黑白霉的生长均没有明显的抑制活性。 对肿瘤细胞的作用显示，白灵菇溶血蛋白对所测试的三种肿瘤细胞系肺癌Lu-04细胞系、乳腺癌Bre-04细胞系、肝癌HepG2细胞系均有较强的抑制作用。 对白灵菇溶血蛋白体外抗病毒活性进行实验，选用多种DNA和RNA病毒。通过对HEL细胞系中Herpes simplex virus type 1(HSV-1)(strain KOS)， Herpes simplex virus type 2(HSV-2)(strain G)，Vaccinia virus， Vesicular stomatitis virus，Thymidine—kinase—deficient HSV-1(TK<'->)(strain KOS)病毒株；HeLa细胞系中Vesicular stomatitis virus， Coxsackie virus B4，Respiratory syncytial Virus病毒株；Vero细胞中 Para—infhenza-3 virus，Reovirus-1，SindbiS virus，Coxsackie virus B4，Punta Toro virus病毒株溶血蛋白抗病毒性质的检测，得到了白灵菇溶血蛋白对不同培养细胞系中多种病毒最小抑制浓度，但相比其细胞毒性，似乎作为抗病毒药的效力不强。其中可以作为潜在药物疗效而进行深入研究的是溶血蛋白抑制HIV-1(Ⅲ<,a>)感染CEM细胞的作用。其他有关真菌类溶血蛋白的资料中均未对蛋白进行广谱的抗病毒实验，这也是首次发现真菌类的天然溶血蛋白具有抑制病毒的作用。

目录

声明

摘要

前言：

1材料和方法

1.1.材料

1.2.方法

1.2.1白灵菇溶血蛋白的分离纯化

1.2.2蛋白纯度检测

1.2.3 Sephacryl S-200分子筛层析测定表观分子量

1.2.4蛋白浓度测定

1.2.5白灵菇溶血蛋白溶血活性测定

1.2.6白灵菇溶血蛋白引起的血细胞钾离子外渗的测定

1.2.7糖抑制实验

1.2.8对真菌生长的抑制作用

1.2.9白灵菇溶血蛋白对肿瘤细胞的作用(采用SRB法)

1.2.10白灵菇溶血蛋白对病毒的抑制作用(采用CPE法)

2.结果

2.1白灵菇溶血蛋白的分离纯化

2.2白灵菇溶血蛋白纯度和分子量测定

2.3白灵菇溶血蛋白溶血活性测定

2.4白灵菇溶血蛋白引起的血细胞钾离子外渗的测定

2.5白灵菇溶血蛋白引起的糖抑制实验

2.6白灵菇溶血蛋白对真菌生长的抑制作用

2.7白灵菇溶血蛋白抗肿瘤活性

2.8白灵菇溶血蛋白在不同的细胞系中的抗病毒活性

3.讨论

参考文献

文献综述 海葵中溶胞性多肽和毒蛋白的研究进展

研究生期间发表的论文

致谢