盐藻钠/磷共转运通道蛋白细胞学定位以及红色荧光蛋白系统改造及在衣藻中的表达

摘要

盐藻(Dunaliella)是一种无细胞壁的单细胞绿藻，具有异乎寻常的抗环境胁迫的能力。因此，它不仅是一个研究植物细胞对渗透胁迫反应调控的模式生物，也是一种重要的极具开发价值的经济藻类。研究表明，盐藻细胞内无机磷是启动渗透调节的“开关”。文章利用SSH技术，从盐藻(Dunaliella．salina)中分离到受高盐和磷饥饿诱导的Na<'+>-依赖型磷转运通道基因DvSPTl。确定其在细胞中的定位，有助于我们进一步了解这种钠/磷转运通道的功能。 本研究中，分别将DvSPT1与CrGFP的N端和C端融合，选择与盐藻亲缘关系比较接近的衣藻作为转化材料。电击转化得到的转化子，通过PCR以及Southern Blot确定融合基因已插入衣藻基因组，并且通过RT-PCR确定其mRNA在细胞中成功转录。将这两种融合蛋白的衣藻转化子分别在激光共聚焦显微镜下进行活体观察，发现DvSPTl与CrGFP的N端融合载体的衣藻转化子在叶绿体相应位置上有强烈绿色荧光。而在DvSPTl与CrGFP的C端融合载体的衣藻转化子细胞中却看不到明显荧光。据此推测DvSPTl是一种定位在细胞叶绿体上的通道蛋白，而且DvSPTl的N端可能存在叶绿体定位信号肽。通过 Western Blot实验证实，CrGFP C端融合的蛋白无法在衣藻中有效存在，可能是由于C端的融合影响了融合蛋白的翻译或稳定性。本研究初步确定了钠/磷共转运通道蛋白DvSPTl是一种定位在细胞叶绿体膜上的通道蛋白，为进一步研究其在盐藻中的表达水平与渗透胁迫的关系奠定了基础，更为深入探索盐藻抗逆机制提供了重要线索。 莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)因其培养条件简单、生长周期短、生长迅速、光合效率高而具有“光合酵母”之称，它已经成为研究植物细胞生物学理想的模式生物体。现在，对衣藻细胞学活体定位的研究中用的比较多的荧光标记是绿色荧光蛋白GFP。本研究首次尝试将从珊瑚中分离得到的红色荧光蛋白单体mRFP在衣藻中表达，但结果表明mRFP不能在衣藻中有效表达。比对衣藻密码子使用频率表，发现衣藻有较强的密码子使用偏好性，原有mRFP的某些密码子在衣藻中使用频率很低。据此，对红色荧光蛋白mRFP基因中衣藻使用频率偏低的八个密码子进行了修改。修改后的密码子使用频率提高了3～22倍。通过与带有核定位信号的Ble基因融合，转化衣藻。经激光共聚焦显微镜观察，在预计的衣藻细胞核的位置上看到有红色荧光，从而实现了红色荧光蛋白在衣藻中的成功表达。本研究为衣藻的细胞学和分子生物学研究提供了除GFP之外的另一个重要的荧光蛋白标记，为在衣藻中同时使用双(多)色荧光标记奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分文献综述

第一章研究植物细胞生物学理想的模式材料----莱茵衣藻

1.1引言

1.2衣藻细胞构造与功能系统研究进展

1.3分子遗传学研究工具

1.4基因表达存在的问题

1.5前景展望

第二章无机磷转运通道研究进展

2.1无机磷转运通道概述

2.2不同物种中无机磷转运通道研究进展

第三章荧光蛋白研究进展

3.1报告基因

3.2绿色荧光蛋白GFP研究进展

3.3红色荧光蛋白RFP研究进展

第二部分 实验材料与方法

1实验材料

2方法

第三部分 研究论文部分

第一章盐藻钠/磷共转运通道蛋白细胞学定位

1.1前言

1.2实验结果

1.3讨论

第二章红色荧光蛋白系统改造及在衣藻中的表达

2.1前言

2.2实验结果

2.3讨论

参考文献

作者在攻读硕士学位期间公开发表的论文

作者在攻读硕士学位期间所作的项目

致谢