杜氏盐藻钠磷共转运通道蛋白的细胞学定位研究

摘要

本研究是对本实验室已获得的盐藻钠磷共转运通道蛋白DvSPT1、DvSPT2进行细胞学定位研究。DvSPT1与DvSPT2基因具有86.1％同源性，我们选择了DvSPT2基因作为研究对象。衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)与盐藻同为团藻目(Volvocales)，其亲缘性与盐藻最为相近且拥有类似的密码子偏好性，此外，衣藻具有稳定的转化系统，外源基因能够整合入基因组并稳定的表达。因此，我们选择衣藻作为研究盐藻基因功能的一种替代材料，以弥补盐藻转化系统不稳定且缺乏可直接用于观察的报告基因的缺憾。 本实验通过激光共聚焦显微镜(Confocal)观察，确定了DvSPT2在衣藻中的细胞学定位：首先分别构建了N端和C端融合衣藻特异表达GFP的钠磷通道DvSPT2的衣藻转化载体，pRBC-express-DvSPT2-crGFP-ble与pRBC-express-crGFP-DvSPT2-ble，并将其分别转化入衣藻中。通过定性PCR检测和Southern杂交鉴定可以确定这两个质粒已经整合入衣藻的基因组并且是多态插入的；通过RT-PCR的方法鉴定发现这两种融合基因的mRNA在衣藻中都可以正常表达。但是在随后的Western杂交实验中却发现在N端融合的DvSPT2没有检测到蛋白杂交条带，而在C端融合的DvSPT2蛋白能够检测到相应的杂交条带。该实验结果表明钠磷通道DvSPT2的信号肽可能位于N端。其次，在上述研究结果的基础上进一步进行了激光共聚焦显微镜(Confocal)观察。结果显示转化pRBC-express-DvSPT2-crGFP-ble的转基因藻株有很强的荧光，且荧光的位置与藻株中叶绿体的发光位置相同。相反，转化pRBC-express-crGFP-DvSPT2-ble的转基因藻株中的荧光基本不可见，Confocal结果中仅有微弱的叶绿体残留荧光，与野生型藻株的荧光照片相似。因此可以进一步得出结论：DvSPT2的蛋白的信号肽定位于该蛋白的N端，且该蛋白在衣藻中是定位于叶绿上的。在确定了钠磷通道在衣藻上的定位的基础上，为了进一步的确定盐藻中钠磷通道蛋白DvSPT1和DvSPT2在盐藻Dunaliellaviridis中的定位，我们制备了钠磷通道蛋白DvSPT1和DvSPT2抗体，以用于免疫电镜的观察。通过软件预测DvSPT1和DvSPT2为膜蛋白，所以我们针对这两个蛋白的亲水区段设计引物将其构建入大肠杆菌表达载体pET32a中，在大肠杆菌中诱导表达，并将诱导蛋白免疫家兔获取抗血清，用于免疫电镜的观察，以期对盐藻中钠磷通道蛋白的定位做进一步的研究。 综合以上两个研究结果，可以对盐藻钠磷共转运通道这两个蛋白在盐藻响应不同胁迫过程中的启动机制及细胞学定位给出系统的阐述，为进一步的功能研究打下基础。

目录

文摘

英文文摘

第一章文献综述

第二章 实验材料与方法

第三章 实验结果与分析

3.1钠磷共转运通道蛋白DvSPT2D在衣藻中的细胞学定位

3.2钠磷通道蛋白DvSPT1，DvSPT2亲水区段抗体的制备

3.3小结与讨论

参考文献

攻读学位期间所参与的项目

攻读学位期间发表的学术论文

致 谢