HBV启动子调控的肝细胞高表达载体构建及抑癌作用研究

摘要

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,每年使大约100万例病人死亡,尽管目前肝癌的治疗方法很多,但仍未能从根本上改变病人的预后.近年来肝癌的基因治疗已经成为生物医学和临床医学研究的热点.肝癌基因治疗的靶向性调控,即调控目的基因特异性导入肝癌细胞或在肝癌细胞中实现特异性表达,最大限度地杀伤肝癌细胞的同时而不损伤正常肝细胞,已成为决定基因治疗效果及可行性的关键因素.分子病毒学研究揭示了HBV的表达调控机制,为利用HBV嗜肝细胞基因表达调控特性构建肝细胞特异表达载体提供了条件.HBV基因组仅有3.2kb,结构紧密,所有调控序列均位于蛋白编码区.HBV 3.5kb、2.4kb、2.1kb和0.9kb的RNA转录物的起始点附近各有一个启动子,分别为C、SPⅠ、SPⅡ和X启动子.另外在1074~1234位核苷酸和1627~1774位核苷酸处有HBV的两个增强子ENⅠ和ENⅡ.该两段序列具有高度保守性,并在其上有多个肝特异转录因子的结合位点,与ENⅠ结合的转录因子有肝细胞特异性的C/EBP、HNF-4和HB<,1>F,与ENⅡ相结合的肝细胞蛋白因子有C/EBP、HNF-4、HLF、HNF3、FTF和E4BP4等.由于与HBV的启动子和增强子特异结合的转录表达调控因子几乎只存在于肝细胞中,而不存在于其它细胞中,决策了肝细胞增强子ENⅠ和ENⅡ具有高度肝细胞专一性,其对HBV在肝细胞中的特异表达有相当重要的贡献,并在一定程度上决策了HBV的嗜肝性.因此,以HBV病毒嗜肝细胞表达密切相关的启动子、增强子为表达调控元件构建肝细胞特异表达载体携带只对肿瘤细胞起抑制或促调亡作用的治疗基因导入人体后,便可达到杀伤肝癌细胞而对正常肝细胞或非肝细胞无影响的目的,充分体出了基因治疗的优势.据此,该论文拟进行以下研究:(1)克隆不同的HBV启动子片段,评价其在肝细胞和非肝细胞中的转录活性.筛选出在肝细胞中特异性表达最强的DNA序列组合形式.(2)构建HBV启动子调控的外源端粒酶hTRT反义RNA,apoptin,IL-24和OSM基因载体,并检测各种治疗基因在体内外的抑癌作用.

目录

英文缩写表

前言

技术路线和实验方案

第一部分 HBV启动子基因克隆及转录活性评价

实验材料

实验方法

结果与讨论

第一部分工作小结

第二部分 HBV启动子调控肝细胞高表达载体的构建

实验材料

实验方法

结果与讨论

第二部分工作小结

第三部分 HBV启动子调控肝细胞高表达载体抑癌作用研究

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

第三部分工作小结

总结

参考文献

致谢

发表和待发表论文

文献综述 组织特异性启动子及其在基因治疗中的应用