Survivin启动子调控的hTERT基因RNAi载体的构建及其肿瘤靶向干扰作用研究

摘要

目的:构建带有肿瘤特异性Survivin启动子、hTERT基因靶向的shRNA表达载体pYr-Survivinp-miR30-hTERT,探讨该载体的肿瘤靶向性及其RNAi作用效率,为RNAi技术在肿瘤基因治疗中的进一步优化进行有益的探索。方法:化学合成hTERT基因shRNA寡核苷酸序列,克隆至质粒pYr-CMV-Mir30-shRNA,构建重组质粒pYr-CMV-Mir30-hTERT;克隆Survivin启动子序列,取代该质粒原有的CMV启动子,构建重组质粒pYr-Survivinp-miR30-hTERT,同时构建阴性对照质粒pYr-CMV-Mir30-NC,以上质粒均进行酶切及测序鉴定。将以上载体分别转染人乳腺癌MCF-7细胞、人宫颈癌Hela细胞及293T细胞,荧光显微镜下观察细胞转染情况,并采用半定量RT-PCR、western blot技术检测MCF-7细胞和Hela细胞中hTERT mRNA和蛋白的表达。结果:重组质粒经酶切及测序鉴定证实均符合设计要求,构建成功;荧光检测结果表明,CMV组在三种细胞中均有荧光蛋白的表达,而Survivin组质粒仅在MCF-7细胞和Hela细胞中表达绿色荧光,转染效率均能达到70%以上,而在293T细胞中则未见荧光;RT-PCR和Western blot的结果均显示MCF-7细胞和Hela细胞的Survivin组和CMV组中hTERT mRNA和蛋白的表达均受到明显抑制(P0.05)。结论:Survivin启动子调控的hTERT基因RNAi载体能有效抑制Survivin阳性肿瘤细胞中hTERT的表达,而对正常细胞不产生影响。