结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的噬菌体检测技术与耐药基因突变研究

摘要

结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)引起的一种慢性传染性疾病，是现在世界上最普遍和最严重的人类传染病之一，也是全世界由单一致病菌致死最多的疾病之一。由于耐药性结核杆菌的出现与传播、艾滋病的流行以及人口的频繁流动等原因，结核病疫情呈现全球性的回升。吡嗪酰胺(Pyrazinamide，PZA)是治疗结核病最有效的一线药物之一，快速准确的PZA耐药性检测技术对临床治疗及控制结核病具有重要的意义。吡嗪酰胺耐药的精确的分子机理还未被阐明，对吡嗪酰胺耐药相关基因pncA的突变进行研究有很大的理论及应用参考意义。 [目的]本研究旨在建立起结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的噬菌体生物扩增(PhageAmplofiedBiologicallyAssay，PhaB)快速检测方法，并探讨和评价所建方法的实际应用价值；同时对结核分枝杆菌PZA耐药菌株的PZA耐药相关基因pncA的突变进行研究，对PZA耐药机制进行初步探索，为以后进行PZA耐药机制研究提供相关实验基础。 [方法]应用PhaB法，对液体培养基的pH值、PZA药物浓度、药物作用时间进行一系列实验，通过正交法筛选和优化检测条件，并对不同的噬菌体侵染环境的恢复方法进行比较来确定最佳恢复方法；应用所建方法对109株结核分枝杆菌临床分离株进行PZA耐药性的测定，并将检测结果与常规药敏检测方法结果进行比较，对两种方法检测结果不相符的菌株进行最低抑菌浓度(minimuminhibitoryconcentration，MIC)测定，以探讨和评价所建方法的应用价值；将结核分枝杆菌PZA耐药株的耐药相关基因pncA进行PCR扩增后对全基因进行测序，对pncA基因突变进行研究。 [结果]PhaB法检测PZA耐药性的最佳条件为液体培养基pH值为5.5、PZA药物浓度200ug/ml、37℃作用48小时，确定离心洗涤为噬菌体侵染环境的恢复方法。对109株结核分枝杆菌临床分离株进行PZA耐药性测定，常规绝对浓度药敏法检测结果为敏感35株，耐药74株；PhaB法检测结果为敏感34株，耐药75株，与绝对浓度法检测结果的符合率为91.7％，对两种检测方法不相符的9株菌株进行MIC测定，结果6株(3株敏感，3株耐药)与PhaB法相符合，如以绝对浓度法测定PZA耐药性结果为考核标准，则PhaB法检测PZA耐药性的敏感性为94.6％(70/74)、特异性为85.7％(30/35)、阳性预测值为93.3％(70/75)、阴性预测值为88.2％(30/34)、准确性为91.7％(100/109)。与常规药敏方法耗时长达6-8周相比，PhaB法检测PZA耐药性仅需2-3天，但与常规药敏方法符合率高且实验结果重复性好。对47株PZA耐药菌株进行pncA基因测序，结果19株的pncA基因存在各种不同形式的突变，突变率达40.43％，在所有突变形式中，除已经见报道的突变形式外，我们还发现了22个新的突变位点，这22种新的突变位点形成12种新的突变形式。 [结论]PhaB法检测结核分枝杆菌PZA耐药性具有快速、操作简便、与常规药敏方法符合率较高等特点，且不需要特殊仪器设备，所用试剂也是一般常规试剂且价格低廉，可以作为PZA耐药性快速检测的筛选方法。所以本法具有重要的临床检测应用和推广价值，特别适合于像我国这样的结核病耐药率高的发展中国家和经济落后的贫困国家和地区推广应用。 本研究也证明，PZA耐药相关基因pncA的突变是结核分枝杆菌对PZA产生耐药的主要原因，更为重要的是我们发现了22种新的突变位点，这22种新的突变形成12种新的pncA基因突变形式，该结果为进一步从分子水平研究PZA耐药的理论研究以及研制PZA耐药检测基因芯片具有重要的参考价值。

目录

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摘要

第一章结核分枝杆菌耐药机制及检测技术研究进展

实验部分第一章结核分枝杆菌PZA耐药性的噬菌体扩增检测方法的建立

实验部分第二章结核分枝杆菌临床分离株PZA耐药性的噬菌体扩增法测定

实验部分第三章结核分枝杆菌PZA耐药菌株pncA基因突变研究

附录：中英文缩写词汇表

参考文献

攻读硕士学位期间发表论文

致谢