TaNHX基因表达载体、Na/H反向运转蛋白RNAi载体构建及功能分析

摘要

本课题以小麦中TaNHX2为研究对象，构建了含有TaNHX2基因的植物表达载体；构建Na+/H+反向运转蛋白基因的RNA干涉表达载体；采用花粉管通道法成功的获得了转基因拟南芥，并进行了相关的分子生物学鉴定及生理验证，为植物耐逆研究积累相关资料。以植物双元载体pBIN438为基本元件，构建含TaNHX2基因的植物表达载体，利用花粉管通道法将TaNHX2基因导入拟南芥，并获得转基因植株，通过实验说明过表达TaNHX2基因提高了转基因拟南芥的耐逆能力；克隆得到拟南芥Na+/H+反向运转蛋白基因的部分片段，构建了抑制Na+/H+反向运转蛋白基因的RNA干涉表达载体，利用花粉管通道法将RNAi载体导入拟南芥，并获得转基因植株，实验说明Na+/H+反向运转蛋白基因的RNAi载体使转基因拟南芥的耐盐和耐旱能力下降。

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英文缩写词表

引言

1.文献综述

1.1盐分对植物的影响

1.1.1盐分对植物外部形态的影响

1.1.2盐胁迫对膜结构的影响

1.1.3盐分使植物光合作用下降、能耗增强

1.1.4盐胁迫诱导的氧化胁迫对植物的影响

1.1.5盐分造成植物营养亏缺（养分离吸收不平衡）

1.1.6盐分对植物内源激素的影响

1.1.7植物对盐胁迫的生理反应

1.2植物耐盐的机制

1.2.1与渗透稳态有关的物质和基因

1.2.2与K+、Na+的稳态有关的蛋白质和基因

1.2.3 Na+区隔化

1.2.4其他离子的稳态（ionic homeostasis）和区隔化

1.2.5跨膜电化学梯度的重建

1.2.6水分的吸收

1.2.7应答调控分子

1.3 RNA干涉的研究进展

1.3.1 RNA干涉现象的发现

1.3.2 RNA干涉的作用机理

1.3.3 RNAi作用的特点

1.3.4 RNAi的生物学意义

1.3.5 RNAi的应用

1.3.6展望

1.4结束语

2.试验材料和方法

2.1试验所涉及的材料

2.1.1菌株及质粒

2.1.2主要仪器设备

2.1.3植物材料

2.1.4酶及试剂

2.2试验方法

2.2.1细菌的培养和苗种的保存

2.2.2大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

2.2.3大肠杆菌质粒的提取(碱裂解法)

2.2.4 DNA片段的快速纯化/回收(参照北京鼎国产品说明书)

2.2.5表达载体的构建

2.2.6植物表达载体的农杆菌转化

2.2.7拟南芥的培养方法

2.2.8菌液的准备

2.2.9转基因拟南芥的制备

2.2.10阳性植株的筛选及纯系的获得

2.2.11转基因植物的分子鉴定

2.2.12转基因植物的耐逆性分析

2.2.13 Na+/H+反向运转蛋白RNAi表达载体的构建

2.2.14 Na+/H+反向运转蛋白RNAi表达载体转化农杆菌、转基因拟南芥的获取及耐逆性分析

3.试验结果

3.1 TaNHX2正义表达载体的构建及功能分析

3.1.1表达载体pBIN438-TaNHX2的构建

3.1.2 TaNHX2表达载体的农杆菌转化

3.1.3抗性植株的获得

3.1.4转基因植株的分子鉴定

3.1.5耐逆性分析

3.2 Na+/H+反向运转蛋白RNAi载体的构建及功能分析

3.2.1 Na+/H+反向运转蛋白RANi表达载体pART27-4的构建

3.2.2 pART27-4表达载体的农杆菌转化

3.2.3抗性植株的获得

3.2.4耐逆性分析

4.讨论

4.1引物的设计及PCR反应条件的优化

4.2 Na+/H+反向运转蛋白的研究

4.3 RNAi在植物的功能基因学研究

总结

参考文献

附图

致谢

攻读学位期间的研究成果