AgO2基因miRNA RNAi慢病毒表达载体与pEGFP-Cl-AgO2表达载体构建及其对血睾屏障相关基因表达的影响

摘要

目的:
　　 我们在前期研究中通过sertoli细胞与生精细胞共培养发现Argonaute2基因可能与血睾屏障相关基因claudin-11表达有关。为了深入研究相关机制,本课题设计构建Ago2基因miRNA RNAi慢病毒表达载体与pEGFP-C1-Ago2表达载体,为研究其对血睾屏障相关基因claudin-11表达的影响奠定基础。
　　 方法:
　　 提取小鼠睾丸组织中总RNA,采用RT-PCR的方法扩增Ago2基因编码区全长,扩增产物克隆入pEGFP-C1载体EcoRI、SalI位点,获得重组表达质粒,并对重组质粒进行PCR、酶切及测序鉴定。应用Lipofectamine(TM)2000将重组质粒转染15P-1细胞,并通过RT-PCR及Western blotting法分别检测Ago2基因及血睾屏障相关基因claudin-11基因和蛋白表达水平。以Ago2为靶向基因,利用www.maidesigner.invitrogen.com/rna1iexpress在线设计网站设计2对Ago2 miR RNAi序列,并将其克隆至pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体中,经测序验证后,用Lipotectamine(TM)2000瞬时转染15P-1细胞,通过RT-PCR法检测Ago2表达情况,选择干扰效果较强的质粒克隆至BLOCK-iTTM HiPerformTM Lentiviral PolⅡmiR RNAi ExpressionSystem,经过氨苄青霉素和氯霉素筛选后,转染293FT细胞中包装慢病毒,转染15P-1支持细胞,杀稻瘟菌素筛选获得稳定转染后,通过RT-PCR及Western blotting法分别检测Ago2及血睾屏障相关基因claudin-11基因和蛋白表达水平。
　　 结果:
　　 1.成功构建了pEGFP-C1-Ago2表达载体,可有效上调15P-1 sertoli细胞Ago2基因表达,成功构建了Ago2基因miRNA RNAi慢病毒表达载体,通过杀稻瘟菌素筛选,获得15P-1 Ago2-miRNA-RNAi稳定株,可显著下调Ago2基因表达。
　　 2.RT-PCR与western blotting结果显示,转染pEGFP-C1-Ago2表达载体上调claudin-11基因表达。相反,转染Ago2-miRNA RNAi慢病毒下调claudin-11基因表达。
　　 结论:
　　 1.成功构建了Ago2基因pEGFP-C1-Ago2表达载体miRNA RNAi慢病毒表达载体,为进一步研究Ago2基因功能奠定了基础。
　　 2.Ago2基因正性调节claudin-11表达。